分离的或重组的核酸分子，其包含： （ａ）如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１中所示的核苷酸序列； （ｂ）核苷酸序列，其是ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１的互补序列； （ｃ）核苷酸序列，其是ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１的简并序列； （ｄ）核苷酸序列，其在高严格条件下与（ａ）、（ｂ）或（ｃ）或者从ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１或者其互补序列衍生的杂交探针杂交； （ｅ）核苷酸序列，其与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１具有至少８０％的序列同一性； （ｆ）上述（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）或（ｅ）的片段，该片段长为至少１０个核苷酸。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备聚酮化合物(polyketides)的材料和方法。提供了用于制备聚酮化合物尤其是聚酮化合物大环内酯疏螺旋体素的酶系统、核酸、载体和细胞。
技术介绍
聚酮化合物是多种生物尤其微生物产生的天然产物。聚酮化合物具有许多重要的药学、兽医和农业用途。聚酮化合物包括大范围的化学结构空间，并且具有多种相关的生物学活性。用于医疗的聚酮化合物包括抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤剂、其他化疗剂、及具有广泛治疗和生物学性质的其他化合物。革兰氏阳性细菌链霉菌属及其近亲的属是聚酮化合物的优秀生产者，并且这些生物中聚酮化合物生物合成的遗传学和生物化学是相对良好表征的(Hopwood，1997)。链霉菌属中聚酮化合物生物合成的基因是成簇的，DNA技术的开发已经使得可能用编码负责它们生物合成的基因的DNA探针筛选基因文库分离全部生物合成基因簇。从而，链霉菌属及其他微生物中越来越多用于聚酮化合物生物合成的基因簇已经被分离并序列，这些基因簇包括例如聚醚莫能菌素(WO 01/68867)、多烯制霉菌素(WO01/59126)和雷帕霉素(Schwecke等人，1995)的基因簇。通过含有羧酸功能的结构单元反复缩合合成聚酮化合物。在该过程的每个阶段，这导致生长链中形成新的β-酮官能和α-侧链分支。聚酮化合物的结构多样性来自它们生物合成途径的许多方面，包括在它们的生物合成中可以利用的起始单元多样性；可能的聚酮化合物链的不同长度；聚酮化合物链装配期间或之后导入的多种α-侧链；聚酮化合物链装配期间或之后导入的多种β-取代；β-酮基可以经历多种加工程度(酮基、羟基、烯酰基和亚甲基)；以及在α-和β-中心可能的多种立体化学。聚酮化合物的合成由称作聚酮化合物合酶(PKS)的酶或者酶复合体以类似物脂肪酸生合成的方式催化。链霉菌属和相关属PKSs分成三个主要类别I型、II型和III型。III型PKSs是与最近发现的植物查耳酮合酶有关的小蛋白质(Moore和Hopke，2000)。III型系统参与少数次级代谢物的生物合成但是可能更普遍地是参与可溶色素的生物合成(Cortés等人，2002)。II型PKS由一些单功能蛋白质组成，这些蛋白质作为多个多肽复合体。简单的芳香族聚酮化合物如放线菌紫素通过几轮链装配形成，该装配由一组II型PKS酶反复执行，这些酶由一组PKS基因编码(Hopwood，1997)。I型PKS是多功能蛋白并且是更复杂的聚酮化合物如红霉素和雷帕霉素的合成所需的。作为本专利的焦点，下面详细描述I型PKS的组织和功能I型PKS组织为多个组件(module)，其中每个组件由一些催化性“结构域”组成，这些结构域是实施一轮链装配所需的(Staunton & Wilkinson，1997)。通常，组件化PKS含有正确数目的组件(装载组件(load module)和延伸组件)以选择和缩合正确数目的装载和延伸单元。例如，红霉素PKS由7个组件(一个装载组件和六个延伸组件)组成以选择和缩合红霉素前体6-脱氧红诺霉素(erythronolide)B的生物合成所需的一个起始单元和六个延伸单元。从而，PKS中存在的组件数和所掺入的单元数之间存在一对一的关系。该一对一关系被描述为“同线性”。如此处所用的术语“延伸组件”指从β-酮酰基-酰基载体蛋白合酶(KS)结构域到下一个酰基载体蛋白(ACP)结构域的一组连续结构域，其完成一轮聚酮化合物链延伸。如此处所用的术语“装载组件”指任一组连续结构域，其完成起始单元向PKS的装载从而使得该起始单元可以被第一个延伸组件的KS结构域利用。除了下一个延伸的羧酸(或者酮化物(ketide))单元缩合到增长的聚酮化合物链上(通过基本KS结构域的催化活性实施)，I型PKS的组件还可以含有具有β-酮还原酶(KR)、脱水酶(DH)和烯酰还原酶(ER)活性的结构域，这些结构域负责链延伸期间新近形成的β-酮基的进一步加工。每个组件中存在的酰基转移酶(AT)和ACP结构域分别负责延伸单元的选择，并在延伸单元向PKS传递过程中限制该增长链。也发现组件化PKS的AT结构域为离散的蛋白(Cheng等人，2003)。所完成的聚酮化合物链通常通过末端硫酯酶(TE)结构域的作用从PKS释放，该末端硫酯酶结构域也通常参与终产物的环化(内酯化)。还使用其他链终止/环化策略，如对雷帕霉素所观察到的加入氨基酸残基和大内酰胺形成的策略(Schwecke等人，1995)，对利福霉素所观察到的大内酰胺形成策略(August等人，1998)，和对粘球酰胺生物合成所观察到的氨基酸掺入然后还原消除策略(Silakowski等人，2001)。总之，在生物合成期间对于每个连续的催化步骤PKS上存在单一酶促结构域，并且这些结构域以明确的顺序使用，该顺序取决于它们在该蛋白内的位置和它们所执行的具体功能。该机理被称为“向前的(processive)”。通过对组件5的KR结构域的一个区域进行符合读框的缺失突变红霉素PKS(也称为6-脱氧红诺霉素(erythronolide)B合酶，DEBS)首先证实了I型PKS的组件化排列(Donadio等人，1991)。由于在向前生物合成的该阶段所突变的KR结构域不能还原β-酮基5，这导致产生红霉素类似物5，6-二脱氧-3-α-mycarosyl-5-氧代红诺霉素B和5，6-二脱氧-5-氧代红诺霉素B。同样地，通过相应编码PKS的DNA进行基因工程并将该DNA导入红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)，改变DEBS2的组件4的ER结构域中的活性部位残基导致产生6，7-脱水红霉素C(Donadio等人，1993)。此外，通过将DEBS3的TE结构域特异重定位到DEBS1的末端改变了DEBS所形成的聚酮化合物链的长度；预期的三酮化物内酯产物产率良好(Cortés等人，1995)。应该指出所描述的变化包括通过序列的缺失、通过序列特异性失活或者通过相同PKS簇内DNA序列的备选并置导致的改变(即它们被认为是“同源改变”)。在WO 93/13663中描述了红霉素PKS的其他此类“同源”改变。I型PKS基因的组件化组织导致这些基因自身的操作而产生改变的聚酮化合物结构。I型PKSs代表聚酮化合物生物合成的装配线，通过改变组件的数目；改变它们针对不同羧酸起始单元和延伸单元的特异性；通过失活、突变、除去、交换或者插入具有不同活性和特异性的结构域；以及通过改变终止或环化结构域的位置改变链或环大小，可以操作聚酮化合物生物合成(Staunton & Wilkinson，1997)。WO 98/01546描述了包含掺入了异源DNA的杂化PKS基因(hybridPKS gene)装配体的产生，其。WO 98/01546描述了产生杂化PKS的方法，其中用编码异源组件、亚组件或结构域的基因替换天然基因产生了具有结构改变的新聚酮化合物。特别地，例如，来自雷帕霉素或莫能菌素PKS的异源DNA的AT结构域可以与红霉素PKS的天然AT结构域交换以便产生具有改变的烷基分支的新聚酮化合物。这种AT结构域交换代表产生真实杂化PKS的第一个实例(Oliynyk等人，1996)。WO 98/01546还一般性地描述了含有本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·萨拉斯，C·门德斯，C·奥拉诺，C·桑切斯，A·F·布拉尼亚，B·威尔金森，C·J·马丁，S·莫斯，P·F·利德雷，M·奥利尼克，
申请(专利权)人：百奥帝卡技术有限公司，奥维耶多大学，
类型：发明
国别省市：
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