疏螺旋体脂蛋白OSPA的纯化方法技术

本发明专利技术提供一种方法，用于纯化适于人类临床应用的疏螺旋体脂蛋白ＯｓｐＡ，该方法是将表达脂蛋白ＯｓｐＡ的宿主细胞于存在两性离子去污剂的情况下裂解，然后在非离子去污剂中实施若干层析步骤。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种纯化疏螺旋体脂蛋白OspA的改进方法。博氏疏螺旋体(广义的)是一种通称，它包括若干疏螺旋体种，这些疏螺旋体种均被认为是莱姆螺旋体病(莱姆病)的病原体。博氏疏螺旋体至少包括博氏疏螺旋体(狭义的)、B.garinii和B.afzelii。该疾病是由多种带有螺旋体的蜱虱的叮咬而加以传播。这种传染病在美国的主要储存库是白脚小鼠，它可以传播给包括人类在内的多种哺乳动物物种。OspA是莱姆病螺旋体广义博氏疏螺旋体的一种保护性抗原。OspA全长基因在疏螺旋体或大肠杆菌中表达可产生一种蛋白，该蛋白可经信号肽酶H翻译后加工，并且含有一种附属的脂类部分。由下文可知，目前已能够对OspA脂蛋白进行适于临床应用的大规模纯化，其实施无需在纯化过程中采用热抽提或酒精抽提方法，并且产生的OspA脂蛋白基本不含去污剂。其次，本专利技术还提供一种方法，用于纯化不含去污剂的疏螺旋体脂蛋白OspA。另外，本专利技术提供纯净并且稳定的脂蛋白OspA，该脂蛋白OspA不含去污剂，并且适于人类的临床应用。专利技术详述本专利技术提供一种用于从实验室规模放大至工业规模的纯化博氏疏螺旋体脂蛋白OspA的简单方法。该方法的优势在于，其纯化无需热抽提或酒精抽提或双相抽提，并且可通过单一步骤获得高水平的纯度。本专利技术的这一方法可产生适于人类临床应用的OspA蛋白。本专利技术还提供OspA脂蛋白，该脂蛋白基本不含去污剂(即只残存有痕量的去污剂)并且可长时间保持稳定(2-8℃的PBS中保持2年)。本专利技术提供一种方法，用于在存在两性离子去污剂以使OspA增溶的情况下对脂蛋白OspA进行纯化，该方法在纯化过程中无需热抽提或酒精抽提。这样可有利地避免对终产物免疫原性的潜在损害(如变性、脱脂化等)。尽管并不希望终产物中含有去污剂，但只要将OspA脂蛋白溶解，则优选的是在存在去污剂的情况下进行连续纯化，这是因为脂蛋白在不存在去污剂的情况下倾向于形成脂类聚集体。在离子交换纯化过程中，优选的是加入另一种去污剂，以保持脂蛋白OspA的溶解状态和非聚集随机状态。该去污剂优选的为非离子型去污剂，如TritonTM(聚氧乙烯醚)或TweenTM(聚氧乙烯山梨糖醇酯)。脂蛋白OspA一旦被纯化，即可在不含有去污剂(表面活性剂)的PBS(磷酸缓冲盐溶液)中保持稳定。终产物中的纯化OspA脂蛋白无需去污剂，因为该脂蛋白一旦被纯化，还可通过采取微团样形式而保持稳定。本专利技术提供一种用于从广义的博氏疏螺旋体菌株中纯化脂蛋白OspA的有利方法。这些菌株包括狭义的博氏疏螺旋体(如ZS7、B31、N40、JD1、297、Sh-2-82等)、B.garinii(如ZQ1、IP90、NE11H、IP3等)和B.afzelii(如ACA-1、Pko、Bo23等)。本专利技术的纯化方案包含以下步骤。在存在两性离子去污剂的情况下将表达脂蛋白OspA的宿主细胞裂解，借此使脂蛋白OspA溶解；实施澄清步骤以去除宿主细胞碎片，该步骤包括流化床离子交换法，然后采用透滤法(或选用离心法)；可选的过滤步骤，以去除所有残留的微粒物质；阴离子交换；阳离子交换；以及凝胶过滤(筛分柱)以从脂化OspA中去除所有非脂化OspA。此外，优选的是在凝胶过滤之后再添加一个除菌过滤步骤。实施例部分将对脂蛋白OspA的纯化做进一步的说明。方案Ⅰ涉及4个层析步骤和1个透滤步骤。该方法包括细胞匀浆(破碎)，可通过，例如，高压细胞匀浆仪来实现；匀浆的稀释(如稀释到光密度(OD)约为20)及匀浆的酸化；然后在流化床上进行阳离子交换(有时称为膨胀床吸附--如StreamlineTMSP系统，Pharmacia)。把匀浆加载到流化床上，然后清洗并利用逐渐增加的离子强度和/或逐渐增加的pH进行洗脱。作为可选步骤，可将洗脱液过滤除菌并透滤。然后把含有脂蛋白OspA的样品加载到阴离子交换树脂上。再把流出物加载到另一阳离子交换树脂上。将树脂清洗并利用逐渐增加的离子强度和/或逐渐增加的pH洗脱OspA。使溶解的OspA流经筛分柱，然后过滤除菌。膨胀床吸附法以流化床为基础。实际上，它是利用上行液流将吸收颗粒提升，以平衡向下的重力。将颗粒提升到刚刚足以使它们悬浮在液流中，借此可产生一个稳定的匀化膨胀床。在一项实施方案中，吸附使用的是StreamlineTM(一种用于阳离子交换的磺酰丙基衍生树脂)。使用透滤法可去除两性离子去污剂，并可浓缩OspA蛋白。在存在非离子型去污剂(如TritonTMX-100)的情况下把滞留物加载到阴离子交换柱上(如Q-Sepharose)。阴离子交换步骤可去除95％以上的杂质。脂蛋白OspA不与该柱结合，从而把流出物注到阳离子交换柱中(如SP Sepharose)。将柱清洗，再洗脱脂蛋白OspA并将其注到凝胶渗透柱中(如Sephacryl S300HR)，以此来替换缓冲液并将非脂化OspA从脂化OspA中分离，同时去除去污剂。将纯化的脂蛋白OspA稀释至标准浓度，并用0.2m无菌膜进行有效的过滤以除菌。离子交换树脂为该领域所熟知。阳离子交换剂包括CM Sephadex、SP Sephadex、CM Sepharose、S Sepharose、CM纤维素等。用于阳离子交换层析的优选树脂为SP或CM Sepharose(Pharmacia)。阴离子交换剂包括DEAE Sephadex、QAE Sephadex、DEAE Sepharose、Q Sepharose、DEAE Sephacel等。用于阴离子交换层析的优选树脂为Q Sepharose(Pharmacia)。凝胶过滤(筛分)树脂包括Sephadex、Sephacryl、Sepharose、Superdex、Superose等。优选的树脂为Sephacryl S树脂，如S-300 HR(Pharmacia)。所得的纯化OspA蛋白即不含去污剂或表面活性剂。方案Ⅱ涉及3个纯化步骤。在存在两性离子去污剂的情况下的细胞裂解(如冻融)步骤；离心步骤以及将含有OspA的上清液(不纯溶液)过滤的可选步骤。当实施可选的过滤步骤时，优选的是使用预滤器，如先用1.2m过滤器再用0.45m过滤器然后进行0.22m过滤。然后在存在非离子型去污剂的情况下把含有脂蛋白OspA的滤出液加载到阴离子交换树脂上。把流出物加载到阳离子交换树脂上。将树脂清洗并利用逐渐增加的离子强度和/或逐渐增加的pH洗脱OspA。使溶解的OspA流经筛分柱，然后过滤除菌。在方案Ⅱ中，细胞裂解可在存在两性离子去污剂的情况下自动发生。而无需进行细胞破碎。也不需实施透滤步骤。与方案Ⅰ相同，阴离子交换步骤可去除95％以上的杂质。OspA在碱性条件下不与QSepharose结合。一旦在不存在去污剂(表面活性剂)的情况下被纯化，脂蛋白OspA即可在PBS(磷酸缓冲盐溶液)中保持纯净和稳定性。两性离子去污剂包括N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯(即SB8、10、12、14、16、18)、CHAPS(3--1-丙磺酸酯)和CHAPSO(3--2-羟基-1-丙磺酸酯)。优选的两性离子去污剂选自N-烷基-N,N-二甲胺基-1-丙磺酸酯。更优选的则为N-十二基-N,N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸酯(称为SB12，亦称作月桂基sulfobet本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化疏螺旋体脂蛋白ＯｓｐＡ的方法，该方法包括：（ａ）将表达脂蛋白ＯｓｐＡ的宿主细胞于存在两性离子去污剂的情况下裂解，以形成含有脂蛋白ＯｓｐＡ的不纯溶液；（ｂ）使不纯溶液澄清，以去除宿主细胞碎片；（ｃ）于存在非离子去污剂的情况 下将该不纯溶液与阴离子交换树脂接触；（ｄ）收集该阴离子交换树脂的流出物并将该流出物与阳离子交换树脂接触；以及（ｅ）实施凝胶过滤步骤洗脱ＯｓｐＡ，其中该纯化方法的实施无需加热。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P德斯蒙斯，R利维恩斯，E默滕斯，B钱普卢维尔，D普莱恩钱普，Y科拉扎，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]