聚酮化合物和其它天然产物的产生制造技术

本发明专利技术涉及聚酮化合物和其他天然产物的产生，还涉及化合物文库和分别的新化合物。一个重要的方面是新ＦＫＢＰ－配体类似物的分离和潜在用途以及产生这些化合物的宿主细胞。本发明专利技术尤其涉及用于有效转化产生ＦＫＢＰ类似物的菌株的方法和重组细胞，其中克隆基因或基因盒被表达以产生新化合物如聚酮化合物（特别是雷帕霉素）ＦＫＢＰ－配体类似物，还涉及它们的制备方法和在其中应用的工具（例如核酸、载体、基因盒和遗传修饰的菌株）。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及聚酮化合物(polyketides)和其他天然产物的产生，还涉及化合物文库和分别的新化合物。一个重要的方面是新FKBP-配体类似物的分离和潜在用途以及产生这些化合物的宿主细胞。本专利技术尤其涉及用于有效转化产生FKBP类似物的菌株的方法和重组细胞，其中克隆基因或基因盒被表达以产生新化合物如聚酮化合物(特别是雷帕霉素)FKBP-配体类似物，还涉及它们的制备方法和在其中应用的工具(例如核酸、载体、基因盒和遗传修饰的菌株)。
技术介绍
雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))(附图说明图1)是由吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NRRL 5491(Sehgal等，1975；Veina等，1975；美国专利号3,929,992；美国专利号3,993,749)产生的带有连接到六氢吡啶羧酸内酯的1，2，3-三羰基部分的亲脂性大环内酯(Paiva等，1991)。其它相关大环内酯(图2)包括FK506(tacrolimus)(Schreiber和Crabtree，1992)、FK520(子囊霉素或immunomycin)(Wu等，2000)、FK525(Hatanaka H，等，1989)、FK523(Hatanaka，H.，等，1988)、antascomicins(Fehr，T.，等，1996)和meridamycin(Salituro等，1995)。对于本专利技术，雷帕霉素采用McAlpine等(1991)的编号规定描述，其优于Findlay等(1980)或化学文摘(11thCumulative Index，1982-1986 p60719CS)的编号规定。雷帕霉素作用的多方面模式显示出了该化合物的药理学价值，并强调了分离该药物的新型衍生物的必要性。雷帕霉素显示出温和的抗真菌活性，主要抗假丝酵母(Candida)种，但也抗丝状真菌(Baker等，1978；Sehgal等，1975；Vézina等，1975；美国专利号3,929,992；美国专利号3,993,749)。雷帕霉素在多种细胞类型中通过靶向信号转导途径抑制细胞增殖，例如通过抑制细胞周期从G1到S-期的进行(Kuo等，1992)的信号转导途径。在T细胞内，雷帕霉素抑制源自于IL-2受体的信号转导，并抑制T细胞的后续自动增殖而导致抑制免疫反应。雷帕霉素的抑制效应并不限于T细胞，因为雷帕霉素抑制许多哺乳动物细胞类型的增殖(Brunn等，1996)。因此，在防止器官同种异体移植物的排斥中以及在治疗自身免疫性疾病中(Kahan等，1991)，具有确定的或预计治疗，雷帕霉素是有效的免疫抑制剂。它引起的负作用比标准的抗排斥治疗的低(Navia，1996)。40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(SDZ RAD，Certican，Everolimus)为雷帕霉素的半合成类似物，其显示出免疫抑制的药理学作用(Sedrani，R.等，1998；U.S.5,665,772)。目前，药物的临床功效正在第三期临床试验中(Kirchner等，2000)。在体外试验中，雷帕霉素酯CCI-779(Wyeth-Ayerst)抑制细胞生长，在体内试验中，其抑制肿瘤生长(Yu等，2001)。目前，药物正用于第三期临床试验。深入研究的领域有(Kahan和Camardo，2001)雷帕霉素在慢性银屑病治疗中的价值(Kirby和Griffiths，2001)、例如在PC12细胞中刺激神经突瘤的功效的潜在应用(Lyons等，1994)、在受到机械损伤后通过血管和平滑肌细胞阻碍对细胞因子的增殖反应(Gregory等，1993)以及其在防止同种异体移植物纤维化中的作用(Waller和Nicholson，2001)。最近报导显示出，在器官移植患者中，雷帕霉素对进行长期免疫抑制治疗患者的癌症发生率比其它免疫抑制疗法低，并且该降低的癌症发生率是因为血管生成的抑制(Guba等，2002)。已报道了亲免素配基的亲神经活性与它们的免疫抑制的活性无关(Steiner等，1997)，并报道了如在专利申请WO01/03692中略述的神经生长刺激受成熟类固醇受体复合体的破坏而提高。已报道了例如高血脂和血小板减少症以及潜在的致畸效应的负作用(Hentges等，2001；Kahan和Camardo，2001)。总共7个丙酸和7个乙酸单位通过头尾缩合到莽草酸衍生的环己烷羧酸起始单元合成雷帕霉素的聚酮化合物骨架(Paiva等，1991)。L-赖氨酸衍生的亚氨基酸、六氢吡啶羧酸通过酰胺键缩合到聚酮化合物骨架的最后一个醋酸上(Paiva等，1993)，然后进行内酯化作用以形成大环。已测定了包含生物合成基因簇的107kb基因组区序列(Schwecke等，1995)。对开放阅读框的分析揭示了编码模块(modular)聚酮化合物合成酶(PKS)的三个大基因(Aparicio等，1996；Schwecke等，1995)。在PKS基因之间有编码具有与非核糖体肽合成酶的激活区相似序列蛋白的rapP基因，且认为其起类似作用(Knig等，1997)。编码PKS基因的区域位于编码认为对于雷帕霉素的合成是必须的酶的24个额外开放阅读框的两侧(Molnár等，1996)。这些包括以下的聚酮化合物后修饰酶两个细胞色素P-450单氧酶，称为RapJ和RapN，相关的铁氧化还原蛋白RapO，和三个潜在的SAM-依赖的O-转甲基酶RapI，RapM和RapQ。其它相邻基因在雷帕霉素的调节和输出中具有推定功能(Molnár等，1996)。所述基因簇也包含基因rapL，认为其产物RapL通过L-赖氨酸的环化脱氨作用催化雷帕霉素前体L-六氢吡啶羧酸的形成(Khaw等，1998；Paiva等，1993)。rapL内导入移码突变使这样的体产生突变体，所述突变体不能产生大量雷帕霉素，并用L-六氢吡啶羧酸添加至生长培养基恢复野生型水平的雷帕霉素产量(Khaw等，1998)。雷帕霉素的环己烷环的生物合成前体物源自于莽草酸途径(Lowden等，1996；Lowden等，2001)。其它密切相关的大环内酯类，例如FK506(tacrolimus)(Schreiber和Crabtree，1992)、FK520(子囊霉素或immunomycin)(Wu等，2000)、antascomicin(Fehr，T.，等，1996)和meridamycin(Salituro等，1995)，都有共同的药效团，其与FK506-结合蛋白(FKBPs)相互作用(图2)。因而，可认为雷帕霉素和相关化合物，例如但不限于FK506、FK520、′hyg′、FK523、meridamycin、antascomicin、FK525和筑波霉素，为″FKBP-配基″。已发表了FK506基因簇的部分序列(Motamedi等，1996；Motamedi等，1997；Motamedi和Shafiee，1998)、′hyg′簇(Ruan等，1997)和FK520基因簇的全部序列(Wu等，2000，美国专利号6,150,513)。在这些簇和雷帕霉素生物合成基因簇内的基因之间有显著的同源性，且在酶功能上具有相似性(Motamedi等，1996)。目前，认为表征的雷帕霉素药理学本文档来自技高网...

【技术保护点】
将宿主菌株转化为含有编码其中一个或多个基因已经被缺失或失活的ＦＫＢＰ－配体的生物合成簇的重组菌株的方法，所述方法包括：ａ）在ｄａｍ↑［－］、ｄｃｍ↑［－］或ｄａｍ↑［－］和ｄｃｍ↑［－］的大肠杆菌菌株中构建接合缺失质粒；ｂ） 从适于接合的所述宿主菌株产生孢子，其中所述菌株生长在１０％到４０％的湿度中并且孢子在５到３０天收获；ｃ）在培养基中将步骤（ａ）的大肠杆菌菌株与来自步骤（ｂ）的孢子接合，其中每升该培养基含有：ｉ）０．５ｇ到５ｇ玉米浆粉，　 　ｉｉ）０．１ｇ到５ｇ酵母提取物，ｉｉｉ）０．１ｇ到１０ｇ碳酸钙；和ｉｖ）０．０１ｇ到０．５ｇ硫酸铁；所述培养基还含有细菌培养用琼脂和淀粉并且已经被干燥导致１－２０％重量损失；和ｄ）任选在适于产生聚酮化合物的 条件下培养重组菌株。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MA格雷戈里，S盖瑟，H佩特克维奇，S莫斯，
申请(专利权)人：百奥帝卡技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]