生物合成丙酮酸的方法技术

公开了一种生物合成丙酮酸的方法，属于生物工程技术领域。菌种为一种光滑球拟酵母（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｇｌａｂｔａｔａ），本方法通过在发酵培养基中添加对氧化磷酸化过程起到解偶联作用的２，４－二硝基苯酚（ＤＮＰ），起到了降低菌体内能荷水平从而提高丙酮酸微生物发酵产量的作用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物合成丙酮酸的方法，属于生物工程

技术介绍
丙酮酸(Pyruvate acid)是糖代谢途径中最重要的中间产物，是多种维生素、氨基酸及其他一些有用物质的重要前体，广泛应用于医药、日用化工、农用化学品、饲料食品等工业及科学研究中。发酵法生产丙酮酸较其他方法如化学合成法、酶转化法等具有原料成本低、反映条件温和等许多优点，引起了研究者的广泛兴趣。研究者选育了一系列高产率和高产量的研究菌株，光滑球拟酵母(7bnz/o戸&g/a^Y^)多重维生素营养缺陷型菌株是其中之一。对于任何一种发酵产品，肯定存在影响该物质高效生产的重要因素。Miyata等的研究重点在于选育丙酮酸的高产菌株，但对如何发挥这些菌株高产丙酮酸 的潜力则研究比较少，例如参见Miyata R, Yonehara T. Improvement of fermentative production of pyruvate from glucose by 7brw/o/w^ g/flZ r齒IFO0005. J. F固e,肠eg. 1996, 82: 475-479。其他一些研究者采用发酵过程优化原理，对多重维生素营养缺陷型菌株 7bnz/o;wg/^ra^生产丙酮酸的发酵过程进行了大量的优化研究工作。例如， 在刘立明，李寅，陈坚的一种基于途径分析提高丙酮酸产量的育种策略，《微生物学报》2005， 45 (1) : 77-80中，在途径分析的基础上提出了一种组成 型降低丙酮酸脱酸酶、但增强乙酰辅酶A合成酶活性的育种策略，以进一步提高光 滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的水平。陈燕，李寅等在葡萄糖对光滑球拟酵母发 酵生产丙酮酸的影响，《无锡轻工大学学报》2001， 20 (2) : 137-141中研 究了初始葡萄糖质量浓度和补料方式对光滑球机酵母WSH—IP303发酵生产丙酮 酸的影响，该文献指出，适宜的初始葡萄糖质量浓度能促进光滑球拟酵母发酵生产 丙酮酸；尽管葡萄糖补料培养可适度提高丙酮酸的产量及产率.但生产强度却有所下降。此外，李寅，陈坚，伦世仪在维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用《微生物学报》2000， 40 (5) : 528-534中研究了烟酸、硫胺素、吡眵醇、生 物素和核黄素对一株光滑球拟酵母(7brw/o戸G/a^a^) WSH-IP303以葡萄糖为 碳源、以氯化铵为唯一氮源生产丙酮酸的影响。然而，目前尚未见文献报道从能量代谢方面研究，通过加入2,4-二硝基苯 酚(DNP)使氧化磷酸化解偶联从而使菌体内能荷水平下降，进而提高丙酮酸产
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生物合成丙酮酸的方法，该方法能以更高的产量 合成丙酮酸。本专利技术的专利技术人从能量代谢方面对丙酮酸生物合成进行了大量深入的研 究，发现通过加入2,4-二硝基苯酚(DNP)能够使得氧化磷酸化解偶联，从而使菌 体内能荷水平下降，进而提高丙酮酸产量。由此完成了本专利技术。在本专利技术的第一方面，提供了一种生物合成丙酮酸的方法，该方法包括利 用多重维生素(NA、 Bio、 B!和Pdx)营养缺陷型菌株光滑球拟酵母(Jbm/o/w^ g/WMM)发酵生产丙酮酸，其特征在于，在发酵生产丙酮酸的过程中向培养基 中添加2,4-二硝基苯酚。在上述方法中，优选是，添加2,4-二硝基苯酚的时间点在从发酵开始之后 0-6小时以及10-40小时的范围。在上述方法中，优选是，2,4-二硝基苯酚的添加方式是选自一次性添加、 分两次添加、分三次或三次以上添加、以及流加中的一种。在上述方法中，优选是，添加的2，4-二硝基苯酚的总浓度为0.2-1.2 mg/L， 以发酵液体积为基准计。在上述方法中，更优选是，添加2,4-二硝基苯酚的时间点在从发酵开始之 后12小时至30小时的范围。在上述方法中，更优选是，以选自以下的任何一种方式添加2,4-二硝基苯 酚(0在从发酵开始后的1611之时一次性添加2,4-二硝基苯酚；(^分两次添加2,4-二硝基苯酚，两次的添加时间点分别是从发酵开始后的16h之时和24h之时；或(iii)在从发酵开始后的16h至24h的时间段内流加2,4-二硝基苯酚。在上述方法中，更优选是，添加的2,4-二硝基苯酚的总浓度为0.4-1.2mg/L，以发酵液体积为基准计；再优选是，添加的2,4-二硝基苯酚的总浓度为0.8-1.2 mg/L，以发酵液体积为基准计；更加优选是，添加的2，4-二硝基苯酚的总浓度为0.9-1.1 mg/L，以发酵液体 积为基准计；特别优选是，添加的2,4-二硝基苯酚的总浓度为lmg/L，以发酵液体积为基 准计。在上述方法中，优选是，发酵生产丙酮酸所采用的培养基具有如下组成一般摇瓶发酵培养基(g/L):葡萄糖90-110g，KH2PO4 4.5-5.5g，MgS(V7H20 0.7-0.9g， NH4C16-8g，微量元素液9-llml，烟酸7-9mg，硫胺素0.013-0.017mg， 盐酸吡哆醇0.35-0.45mg，生物素0.03-0.04mg，核黄素0.08-0.12mg ， CaC03 36-44g, pH4.5-5.5，用水配制；发酵罐发酵培养基组成(g/L):葡萄糖90-110g， KH2P04 4.5-5.5g， MgS04'7H20 0.7-0.9g， NH4C1 6-8g，微量元素液9-llml，烟酸7-9mg，硫胺素 0.013-0.017mg ，盐酸吡眵醇0.35陽0.45mg ，生物素0.03-0.04mg ，核黄素 0.08-0.12mg， pH4.5-5.5，用水配制；微量元素液CuS04'5H20 0.04-0.06g， FeS04'7H20 1.8陽2.2g， MnCl2'4H20 0.18-0.22g/L， CaCl2.2H20 1.8-2.2g/L， ZnCl2 0.45曙0.55g， 1.8-2.2mol/L HCl溶解 后定容至IL。在上述方法中，优选是，发酵生产丙酮酸所采用的反应条件如下发酵过程的培养方法温度为29-3rC，转速为200-300r/min; 发酵罐发酵温度为29-31。C，通气量2-5L/(L'min)，初始搅拌转速为 200-300r/min。本专利技术还提供了2,4-二硝基苯酚在生物合成丙酮酸过程中用于提高丙酮酸 产量的应用。附图说明图l是糖酵解途径中酶的调控作用的示意图。 图2是氧化磷酸化偶联的化学渗透假说示意图。图3是2，4-二硝基苯酚作用机制的示意图。 图4是2,4-二硝基苯酚(DNP)和丙酮酸(Pyr)的UV吸收谱图。 图5A示出了摇瓶水平添加2，4-二硝基苯酚中添加时间对丙酮酸生物合成的 影响。图5B示出了摇瓶水平添加2,4-二硝基苯酚中添加量对丙酮酸生物合成的影响。图6A示出了5L发酵罐放大摇瓶工艺中葡萄糖浓度、丙酮酸浓度和菌体浓度 (以OD值表示)与时间的关系曲线图。图6B示出了5L发酵罐放大摇瓶工艺中的菌体内能荷水平(EC)与时间的关 系曲线图。图7A示出了按试验例4进行试验的菌体浓度(以OD值表示)与时间的关系曲 线图。图7B示出了按试验例4进行试验的丙酮酸浓度与时间的关系曲线图。 图7C示出了按试验例4进行试验的葡萄糖浓度与时间的关系曲线图。 图7D示出了按试验例4进行试验的菌体内能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物合成丙酮酸的方法，该方法包括利用多重维生素（ＮＡ、Ｂｉｏ、Ｂ↓［１］和Ｐｄｘ）营养缺陷型菌株光滑球拟酵母（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｇｌａｂｔａｔａ）发酵生产丙酮酸，其特征在于，在发酵生产丙酮酸的过程中向培养基中添加２，４－二硝基苯酚。

【技术特征摘要】
1.一种生物合成丙酮酸的方法，该方法包括利用多重维生素(NA、Bio、B1和Pdx)营养缺陷型菌株光滑球拟酵母(Torulopsis glabtata)发酵生产丙酮酸，其特征在于，在发酵生产丙酮酸的过程中向培养基中添加2，4-二硝基苯酚。2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，添加2,4-二硝基苯酚的时间点在 从发酵开始之后0-6小时以及10-40小时的范围。3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，2,4-二硝基苯酚的添加方式是选 自一次性添加、分两次添加、分三次或三次以上添加、以及流加中的一种。4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，添加的2,4-二硝基苯酚的总浓度 为0.2-1.2mg/L，以发酵液体积为基准计。5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，添加2,4-二硝基苯酚的时间点在 从发酵开始之后12小时至30小时的范围。6. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，以选自以下的任何一种方式添 加2，4-二硝基苯酚(i)在从发酵开始后的16h之时一次性添加2,4-二硝基苯酚； (ii)分两次添加2,4-二硝基苯酚，两次的添加时间点分别是从发酵开始后的16h 之时和24h之时；或(iii)在从发酵开始后的16h至24h的时间段内流加2，4-二硝基苯酚。7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，添加的2,4-二硝基苯酚的总浓度 为0.4-1.2mg/L，以发酵液体积为基准计；优选是，添加的2,4-二硝基苯酚的总浓度为0.8-1.2 mg/L，以发酵液体积为 基准计；更优选是，添加的2,4-二硝基苯酚的总浓度为0.9-1.1 mg/L，以发酵液体积 为基准计；特别优选是，添加的2,4-二硝基苯酚的总浓度为lmg/L，以发酵液...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈长华，李友元，范栋，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[]