真菌甲基化反应中胞内2,4,6‑三氯苯甲醚和2,4,6‑三氯苯酚的提取方法技术

本发明专利技术公开了真菌甲基化反应中胞内嗅味化合物2,4,6‑三氯苯甲醚和2,4,6‑三氯苯酚的提取方法，包括真菌细胞壁破壁和提取，用布氏漏斗将真菌与培养液分离后，再用超纯水冲洗真菌表面；将冲洗后的真菌抽滤至近干，取0.2g真菌，经破壁处理后，在4℃，12000rpm下离心10min；上清液用于胞内溶解态化合物的测定；细胞残片用一定量超纯水冲洗后，用30mL乙醚提取，合并提取液，在50mL的旋转蒸发瓶中旋蒸至干，用1mL甲醇定容；取100μL的甲醇定容的样品置于5mL水中，用LDS‑DLLME‑GC/ECD法测定分析，这部分的化合物为胞内结合态；所述真菌细胞壁破壁采用反复冻融破壁。

The method for extraction of fungal methylation reaction of intracellular 2,4,6 and 2,4,6 three spanon three chloro phenol

The invention discloses a method for extraction of fungal methylation reactions in intracellular odor compounds 2,4,6 three and 2,4,6 spanon three chloro phenol, including fungal cell wall and extraction, using Buchner funnel fungus and cultivation liquid separation, and ultra pure water washing the surface of fungi; fungus filtration after washing to dry 0.2g, fungi, after broken, at 4 DEG C, 12000rpm centrifugal 10min; supernatant for determination of intracellular dissolved compounds; the cell debris with a certain amount of ultra pure water after washing, 30mL was extracted by ether extract was 50mL in rotary evaporation bottle rotary steam to dry, with 1mL methanol capacity take 100 mu L; volume of methanol water samples were placed in the 5mL, using LDS DLLME analysis GC/ECD method, this part of the compound as an intracellular binding state; the fungal cell wall broken by repeated freeze-thaw.

【技术实现步骤摘要】
真菌甲基化反应中胞内2,4,6-三氯苯甲醚和2,4,6-三氯苯酚的提取方法
本专利技术涉及真菌胞内化合物提取技术，具体涉及真菌甲基化反应中胞内2,4,6-三氯苯甲醚和2,4,6-三氯苯酚的提取方法。
技术介绍
Wu和Jüttner首次调查了嗅味化合物2-甲基异莰醇(2-Methylisoborneol,MIB)和土臭素(Geosmin,GSM)在蓝藻门小颤藻(Oscillatoriatenuis)细胞内和细胞外的分布，提出MIB和GSM大部分是累积在细胞内而不是释放到环境中,这对之后MIB和GSM的去除研究具有指导性的意义。2,4,6-三氯苯甲醚(2,4,6-Trichloroanisole,2,4,6-TCA)和2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-Trichlorophenol,2,4,6-TCP)是饮用水中常见的嗅味化合物。相关文献报道证明，在饮用水水厂处理中，2,4,6-TCA的生成是由真菌甲基化其前体物2,4,6-TCP而来,且2,4,6-TCP和生成的2,4,6-TCA有部分保留在细胞内部。细胞内的2,4,6-TCA和2,4,6-TCP是以胞内溶解态形式还是胞内结合态形式存在,决定了水处理过程中,真菌细胞破损时,这些化合物是随同真菌一起被过滤掉还是重新释放到水体中。文献报道表明，传统的化学-物理处理工艺(絮凝、沉降、过滤和加氯)对溶解于水体中(真菌细胞外)的2,4,6-TCA无明显去除效果，对细胞内的嗅味化合物有显著的去除效果。但泵压、预氧化等会使细胞破损，导致细胞内的2,4,6-TCA释放到水环境中，带来进一步的处理问题。真菌甲基化过程中2,4,6-TCA形态分布的研究，有助于饮用水处理中2,4,6-TCA针对性措施的实施。要研究细胞内不同形式化合物的分布，首先需要使细胞壁破碎，才可以保证化合物从细胞内部释放出来，所以，提取和研究细胞内的化合物的基本步骤是细胞壁破碎方法。真菌的细胞壁与细菌的细胞壁或者哺乳动物的细胞膜相比较而言，其细胞壁较厚，结构非常复杂且坚韧。哺乳动物的细胞膜主要组成是脂质和蛋白质，当使用蛋白酶处理时，容易溶解。与此有显著性差异的是，真菌的细胞壁对紫外线、化学分解和酶消化有很强的抵抗力。这是因为真菌细胞壁的组成包括甲壳质、葡聚糖、脂类和多肽类。目前有一些真菌细胞破碎方法方面的文献，但它们集中于比较破碎方法对DNA提取效果的影响。DNA是一种长链聚合物，其结构和性质与小分子化合物差异很大。2,4,6-TCA形态分布的研究中，细胞破碎方法的选择需要考虑细胞的破碎程度和破碎方法对化合物提取效果的影响两个方面。常见的细胞壁破碎方法有物理破壁方法(比如反复冻融、液氮研磨、水浴)、化学破壁方法(比如酸处理、碱处理)和机械破壁方法(比如超声波破碎)等。反复冻融法是一种经典的细胞破壁方法。在反复冻融过程中，细胞膜脂质在–196℃(液氮)的低温下脆化，倾向于膨胀破碎；但在37℃解冻后，细胞得到修复。这样反复膨胀–修复，增加了细胞破碎的可能性。液氮研磨中，液氮是低温液体，接触到鲜活组织后，可以使其快速冷冻，研钵研磨可以使冷冻的细胞达到破碎的效果。Karakousis等先用液氮冷冻白念珠菌，再用研钵配套研磨杵进行真菌研磨。该方法的缺陷在于，对于高通量样品，难以应对实验需要，操作相对费时，样品及结果不稳定，且液氮操作过程中容易造成皮肤冻伤。热水浴可以使细胞内部的热压升高导致细胞的破裂；酸处理会使蛋白质水解成氨基酸，从而达到细胞破碎的效果。酸处理法是一种化学渗透法，它的作用原理主要是根据盐酸作用于细胞壁中的一些成分(主要是多糖和蛋白质)，从而改变细胞壁这些成分的空间结构，从而导致细胞壁结构由原来的紧密变得疏松，再经过沸水浴或者速冷处理，导致细胞壁结构破坏，最终使胞内物质溶出。碱处理法是用碱液处理真菌细胞壁，在该过程中，包含有皂化反应和渗透作用，最终导致细胞壁的分解和破裂。刘洪涛等采用NaOH碱液加热真菌的细胞壁使其裂解，再提取裂解液中细胞壁所含，并进一步测定甾醇在真菌细胞壁中的含量变化。使用碱液裂解真菌细胞壁，该方法简单易操作，但它并不适用于对酸碱或者加热不稳定的生物样品。而且操作过程中会存在液体挥发和多次洗涤中和，会导致测定结果的偏差的存在。与此同时，实验操作一定要谨慎，要避免被热碱液灼伤或腐蚀。超声波破碎把电能通过能量转换，转换成声能，而声能会在液体介质中，转变成为许多个独立存在的、密集的小气泡，这些小气泡在细胞周围迅速炸裂，传递动能诱导细胞壁破裂，同时，细胞壁温度快速、短暂地升高，加速细胞的破裂。在各科研单位中超声细胞破碎仪较常见，它的操作方便易行，可对动物组织和细胞起到较好的破碎效果，然而对于真菌细胞而言，真菌相对坚硬的细胞壁的存在，使其破壁效率较低，因此单独使用时难以达到理想的破壁效果。另外，在超声破碎过程中会产生一定的热量，对实验样品的稳定性可能会造成不良影响，而超声波产生的化学自由基团能使敏感性活性物质变形失活，同时在其工作过程中会产生刺耳的噪声。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了真菌甲基化反应中胞内2,4,6-三氯苯甲醚和2,4,6-三氯苯酚的提取方法。本专利技术的技术方案是：真菌甲基化反应中胞内2,4,6-三氯苯甲醚和2,4,6-三氯苯酚的提取方法，包括真菌细胞壁破壁和提取，用布氏漏斗将真菌与培养液分离后，再用超纯水冲洗真菌表面；将冲洗后的真菌抽滤至近干，取0.2g的真菌，经破壁处理后，在4℃，12000rpm下离心10min；上清液用于胞内溶解态化合物的测定；细胞残片用一定量超纯水冲洗后，用30mL乙醚提取，合并提取液，在50mL的旋转蒸发瓶中旋蒸至干，用1mL甲醇定容；取100μL的甲醇定容的样品置于5mL水中，用LDS-DLLME-GC/ECD法测定分析，这部分的化合物为胞内结合态；所述真菌细胞壁破壁采用反复冻融破壁。本专利技术的进一步改进包括：所述反复冻融是：将0.2g的真菌样品置于5mL的冻存管中，加入3mL细胞裂解液，摇匀；然后，将冻存管在液氮罐中冷冻5min，取出，放入37℃的水浴中5min，如此反复操作10-12个循环。所述裂解液组成为：2％的十六烷基三甲基溴化铵，1.4molL-1的NaCl，20mmolL-1的乙二胺四乙酸，20mmolL-1的Tris-HCl，pH调至8.0。所述的真菌为丝状真菌。本专利技术对比了3种物理破壁方法(反复冻融、液氮研磨、水浴)、2种化学破壁方法(酸处理、碱处理)和1种机械破壁方法(超声波破碎)，共计6种方法对真菌细胞壁的破碎效果。以真菌细胞的破碎程度以及破壁方法对化合物2,4,6-TCA和2,4,6-TCP提取效果的影响，这两个方面为评价指标，选出适用于真菌甲基化过程中2,4,6-TCA形态分布研究的最佳细胞壁破碎方法。在此基础上，进而展开真菌甲基化过程中2,4,6-TCA形态分布的研究。附图说明图1a.不破壁米曲霉的显微镜照片(×400)。图1b.反复冻融后米曲霉的显微镜照片(×400)。图1c.液氮冷冻研磨后米曲霉的显微镜照片(×400)。图1d.热水浴后米曲霉的显微镜照片(×400)。图1e.酸处理后米曲霉的显微镜照片(×400)。图1f.碱处理后米曲霉的显微镜照片(×400)。图1g.超声波破碎后米曲霉的显微镜本文档来自技高网...

【技术保护点】
真菌甲基化反应中胞内2,4,6‑三氯苯甲醚和2,4,6‑三氯苯酚的提取方法，包括真菌细胞壁破壁和提取，其特征在于，用布氏漏斗将真菌与培养液分离后，再用超纯水冲洗真菌表面；将冲洗后的真菌抽滤至近干，取0.2g的真菌，经破壁处理后，在4℃，12000rpm下离心10min；上清液用于胞内溶解态化合物的测定；细胞残片用一定量超纯水冲洗后，用30mL乙醚提取，合并提取液，在50mL的旋转蒸发瓶中旋蒸至干，用1mL甲醇定容；取100μL的甲醇定容的样品置于5mL水中，用LDS‑DLLME‑GC/ECD法测定分析，这部分的化合物为胞内结合态；所述真菌细胞壁破壁采用反复冻融破壁。

【技术特征摘要】
1.真菌甲基化反应中胞内2,4,6-三氯苯甲醚和2,4,6-三氯苯酚的提取方法，包括真菌细胞壁破壁和提取，其特征在于，用布氏漏斗将真菌与培养液分离后，再用超纯水冲洗真菌表面；将冲洗后的真菌抽滤至近干，取0.2g的真菌，经破壁处理后，在4℃，12000rpm下离心10min；上清液用于胞内溶解态化合物的测定；细胞残片用一定量超纯水冲洗后，用30mL乙醚提取，合并提取液，在50mL的旋转蒸发瓶中旋蒸至干，用1mL甲醇定容；取100μL的甲醇定容的样品置于5mL水中，用LDS-DLLME-GC/ECD法测定分析，这部分的化合物为胞内结合态；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：白秀芝，李海普，张婷，杨兆光，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43