一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法技术

本发明专利技术公开了一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法，属于生态学及化学分析技术领域。使用50％甲醇水溶液(质量浓度)提取芦苇根酚酸物质，HLB型固相萃取柱纯化提取液，高效液相技术(HPLC)分离测定芦苇根中8种酚酸类物质。本发明专利技术的芦苇根中酚酸类化合物的高效液相色谱测定方法，能有效的分离和测定出芦苇根中的多种酚类化合物，操作简单，测定结果重复性好，精确度高，整个样品分离测定过程仅需30min即可完成。

A method for the separation and determination of phenolic acids in reed root

The invention discloses a method for the separation and determination of phenolic acids in reed root, which belongs to the field of ecology and chemical analysis. The phenolic acids from Phragmites australis root were extracted by 50% methanol solution (mass concentration), and HLB solid phase extraction column was used to purify the extract, and 8 kinds of phenolic acids in Phragmites australis were separated by high performance liquid chromatography (HPLC). Determination method of high performance liquid phenolic compounds of the present invention in reed chromatography, effective separation and determination of a variety of phenolic compounds, reed root in simple operation, the determination results of good repeatability, high accuracy, the sample separation and determination process only needs to complete the 30min.

【技术实现步骤摘要】
一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法
本专利技术涉及芦苇(Phargnitescommunis)根中酚酸类物质的分离测定方法，属于生态学及化学分析

技术介绍
化感作用(Allelopathy)—词源于希腊语Alldon(相互)和Pathos(损害、妨碍)，又称他感作用、克生作用和互感作用等。化感作用的概念最早是由Molish在1937年首次提出，他将其定义为植物(微生物)产生的生物化学物质对其他植物产生某种作用的现象，包括促进作用和抑制作用。Rice于1984年对化感作用完整定义为：植物(或微生物)通过释放化学物质到环境中而产生对同种或异种植物(或微生物)直接或间接的有害或有益作用。化感物质(Allelochemical)指植物通过次生代谢作用向环境释放的用于传递信息或作为媒介的化学物质，化感物质存在于植物的根、茎、叶、花、果实或种子中。常见的化感物质大体可分为4大类：酚酸类、萜类、糖苷类以及生物碱。芦苇是常见的湿地强化感植物，甚至对加拿大一枝黄花和互花米草等入侵植物均有不同程度的化感抑制作用。研究表明芦苇根系分泌物中存在大量酚酸类化感物质，目前测定该类物质的常用方法包括光度法、毛细血管电泳法、色谱分析法、电化学分析法和流动注射分析法。其中，色谱分析法中的高效液相色谱法(HPLC)应用较多，但它仍存在诸如各类酚酸类物质需分别在不同的条件下测定、检测时间长、流动相组成和梯度洗脱条件复杂等不足。对于芦苇这种强化感植物，其根部所分泌的酚酸类物质成分相当复杂，目前尚无比较系统的分离、鉴定和测定方法，本专利技术则是在利用固相萃取技术对芦苇根进行前期处理的基础上，优化出适宜的高效液相色谱条件，使芦苇根部多种酚酸得到精确的分离和测定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法，所述方法通过优化的预处理以及配套的后续处理，最终使用HPLC将芦苇根中的多种酚酸类物质分离出来并进行测定。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法，按照下述步骤进行：步骤1)N种酚酸类物质标准对照品(以下统称“标品”)溶液的配制；步骤2)使用一定浓度的醇类溶剂提取芦苇根样品中的酚酸类物质，离心后过滤，取滤液浓缩；步骤3)使用固相萃取柱纯化滤液，得到样品溶液；步骤4)将样品和不同浓度的酚酸标品注入高效液相色谱仪，得到色谱图；步骤5)以峰面积y对浓度x绘制N种酚酸标品的标准曲线，得到每种标品的回归方程，将样品色谱图与标品色谱图进行对比，鉴定得出样品中所含酚酸物质的种类，并根据回归方程，计算各酚酸物质的含量。优选地，所述步骤1)中一定浓度的醇类溶剂为质量浓度为50％的甲醇水溶液。优选地，所述提取过程具体为，常温下使用振荡器振荡提取6小时。溶解条件的选取，是由于温度过高会使一些酚酸类物质降解损失，预处理时间过短不能充分提取酚酸类物质。优选地，所述步骤2)中在真空条件下蒸发浓缩至3mL，浓缩温度为30℃，优选地，所述步骤3)中使用的固相萃取柱为HLB型固相萃取柱。纯化前，对固相萃取柱进行激活，优选地，激活的具体过程为：用1mL纯甲醇活化后用1ml含1％乙酸的水溶液(质量浓度，下同)洗脱，以1mL/min的流速上样，随后再经1mL同浓度的乙酸水溶液洗脱，再用2mL酸化甲醇(含1％乙酸)洗脱，收集洗脱液，过0.22um有机过滤膜。优选地，所述步骤4)中的HPLC采用梯度洗脱的方式进行，所述梯度洗脱的流动相由甲醇和乙酸水溶液组成，其中甲醇为色谱纯，水溶液为pH＝2.6、含1％乙酸(质量浓度)的水溶液。甲醇为流动相A，乙酸水溶液为流动相B。洗脱过程中，梯度洗脱条件为0-8min，40％的B；8-19min，65％的B；19-30min，90％的B。优选地，所述步骤4)中HPLC的柱温为30℃，流动相的流速为1mL/min。本专利技术通过预处理芦苇根样品，使得样品中的酚酸类物质较好地溶出并稳定地保藏在溶剂中，最终通过HPLC的手段实现样品中各酚酸类物质的分离。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为:(1)本专利技术的分离方法通过高效液相色谱进行，过程易于控制，所选取的色谱条件方法稳定可靠；(2)本专利技术的方法可以分离得到芦苇根中的8种酚酸类物质，为植物根系酚酸类物质的检测提供有力指导。附图说明图1为本专利技术没食子酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸、香豆酸、丁香酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、咖啡酸10种酚酸混合标品色谱图。其中1.没食子酸；2.香豆酸；3.咖啡酸；4.对羟基苯甲酸；5.香草酸；6丁香酸；7.对香豆酸；8.阿魏酸；9.水杨酸；10.苯甲酸。图2-6为本专利技术实例一中五份芦苇根样品的色谱图；其中1.没食子酸；2.香豆酸；3.香草酸；4丁香酸；5.对香豆酸；6.阿魏酸；7.水杨酸；8.苯甲酸。具体实施方式一、依照以上方法分离测定芦苇根中多种酚酸类物质的种类和含量1.材料1.1仪器ThermoUltiMate-3000型高效液相色谱；C18反相色谱柱；旋转蒸发仪；高速离心机。1.2试剂酚酸类物质标品十种，分别为：没食子酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸、香豆酸、丁香酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸、水杨酸和咖啡酸，以上标品均购自上海晨易生物科技有限公司，甲醇为色谱纯，乙酸为分析纯，实验所用水均为超纯水。1.3样品取5份芦苇根样品，每份样品鲜重10g。2.方法与结果2.1混合标品溶液制备分别称取标品没食子酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸、香豆酸、丁香酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸、水杨酸和咖啡酸0.001mg溶于1mL质量浓度50％的甲醇水溶液中作为标品储备液，于冰箱4℃避光保存，使用前，根据实验需要将此标品储备液用质量浓度50％的甲醇水溶液稀释2、5、10、25倍，配制成系列标品混合溶液，测定前经0.22um微孔滤膜过滤。2.2样品的制备取10g芦苇根，用100mL质量浓度50％的甲醇水溶液常温下震荡提取6小时，后上离心机分离取上清液再用旋转蒸发仪(真空，30℃)浓缩成3mL样品溶液，取滤液过HLD型固相萃取柱纯化，纯化前，对HLD型柱进行激活，用1mL纯甲醇活化后用1ml含1％乙酸的水溶液(质量浓度，下同)洗脱，以1mL/min的流速上样，随后再经1mL同浓度的乙酸水溶液洗脱，再用2mL酸化甲醇(含1％乙酸)洗脱，收集洗脱液，过0.22um有机过滤膜。2.3色谱条件色谱柱：ThermoAeeueorexLe18；柱温：30℃；流动相：A液为甲醇；B液为pH＝2.6、含1％乙酸(质量浓度)的水溶液；梯度洗脱条件为0-8min，40％B；8-9min，65％B；19-30min，90％B；流速：1mL/min；检测器：ThermoDAD-3000；检测波长：280nm。在上述色谱条件下，取标品和样品制备溶液分别进样，记录色谱图。2.4混合标品溶液和样品色谱图见附图1-6。图1为本专利技术没食子酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸、香豆酸、丁香酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、咖啡酸10种酚酸混合标品色谱图。其中1.没食子酸；2.香豆酸；3.咖啡酸；4.对羟基苯甲酸；5.香草酸；6丁香酸；7.对香豆酸；8.阿魏酸；9.水杨酸；10.苯甲酸。图2-6为本专利技术实例一中五份芦苇根样品的色谱图。其中1.没食子酸；2.香豆酸；3.香草酸；4丁本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法，其特征在于按照下述步骤进行：步骤1)N种酚酸类物质标准对照品(以下统称“标品”)溶液的配制；步骤2)使用一定浓度的醇类溶剂提取芦苇根样品中的酚酸类物质，离心后过滤，取滤液浓缩；步骤3)使用固相萃取柱纯化滤液，得到样品溶液；步骤4)将样品和不同浓度的酚酸标品注入高效液相色谱仪，得到色谱图；步骤5)以峰面积y对浓度x绘制N种酚酸标品的标准曲线，得到每种标品的回归方程，将样品色谱图与标品色谱图进行对比，鉴定得出样品中所含酚酸物质的种类，并根据回归方程，计算各酚酸物质的含量。

【技术特征摘要】
1.一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法，其特征在于按照下述步骤进行：步骤1)N种酚酸类物质标准对照品(以下统称“标品”)溶液的配制；步骤2)使用一定浓度的醇类溶剂提取芦苇根样品中的酚酸类物质，离心后过滤，取滤液浓缩；步骤3)使用固相萃取柱纯化滤液，得到样品溶液；步骤4)将样品和不同浓度的酚酸标品注入高效液相色谱仪，得到色谱图；步骤5)以峰面积y对浓度x绘制N种酚酸标品的标准曲线，得到每种标品的回归方程，将样品色谱图与标品色谱图进行对比，鉴定得出样品中所含酚酸物质的种类，并根据回归方程，计算各酚酸物质的含量。2.根据权利要求1所述的一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法，其特征在于所述步骤1)中一定浓度的醇类溶剂为质量浓度50％甲醇水溶液。3.根据权利要求1所述的一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法，其特征在于所述提取过程具体为：常温下使用振荡器振荡提取6小时；溶解条件的选取，是由于温度过高会使一些酚酸类物质降解损失，预处理时间过短不能充分提取酚酸类物质。4.根据权利要求1所述的一种芦苇根中酚酸类物质的分离测定方法，其特征在于所述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：付为国，孙盈，王雨轩，韦晨，薛珂，李振，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32