一种蜂胶中多酚类物质HPLC /Q‑TOF‑MS检测方法技术

本发明专利技术涉及一种蜂胶中多酚类物质HPLC /Q‑TOF‑MS检测方法，其方法如下：取蜂胶原料用乙醇超声提取三次制得储备液，采用HPLC/Q‑TOF‑MS，取多酚类标准物共二十种，分别在指定色谱质谱条件测定每种多酚类标准物，确定每种多酚类标准物的离子化形式，形成多酚类物质数据库，通过自动匹配保留时间、准确质量数，鉴别蜂胶样品中存在的多酚类物质，确定蜂胶样品中二十种多酚类物质含量；本发明专利技术具有快速、高通量、高精度和高可靠性等优势，能够对蜂胶中主要多酚类物质进行准确筛查，为蜂胶提取物质量评价提供了一种手段，有利于进一步制定蜂胶提取物的质量监控标准。

A HPLC /Q TOF propolis polyphenols MS detection method

The invention relates to a propolis polyphenols in HPLC /Q TOF MS detection method, the method is as follows: propolis ethanol extraction three times for liquid reserves, using HPLC/Q TOF MS, taking a total of twenty kinds of polyphenols standard, determination of each kind of polyphenol standards respectively in the specified column mass spectrometric conditions, ionized form identifies each polyphenols standard, the formation of polyphenols database, through the automatic matching of retention time, accurate mass number, identifying the determination of polyphenols in propolis, propolis samples to determine twenty kinds of polyphenolic substances content; the invention has the advantages of rapid, high throughput, high precision and high reliability and other advantages. Able to perform accurate screening of major polyphenols in propolis, provides a means for the quality evaluation of propolis extract, is conducive to the further development of propolis extract Quality monitoring standard.

【技术实现步骤摘要】
一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法
本专利技术涉及一种HPLC/Q-TOF-MS（高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱）来检测蜂胶提取物中多酚类物质的方法,属于蜂胶提取物的检测

技术介绍
蜂胶是由意大利蜂（ApismelliferaL.）的工蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶粘性物质。蜂胶是一种历史十分悠久的传统天然药物，现已收录于《中华人民共和国药典》（2010年版，一部）。同其他蜂产品一样，蜂胶具有广泛的药理学活性，如抗菌、抗病毒、抗原虫、抗氧化、抗癌、麻醉、创伤修复、消炎、免疫调节、预防龋齿、心血管保护等。而也正是由于蜂胶具有多重药理活性，蜂胶产品在市场上受到广大消费者的青睐，现已广泛应用于医药、保健食品、化妆品等领域。蜂胶良好的生物活性与其黄酮、酚酸等多酚类化合物的含量较高有着密不可分的关系。近年来，对蜂胶中黄酮类化合物含量分析的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)。在现有的文献中，由于蜂胶中成分复杂，在达到较好的分离度的同时，检测时间也就相对加长，每个样品的检测时间要达到60分钟以上，效率低，不利于对蜂胶质量控制的现场检测，且作为流动相使用的溶剂耗费量大，不经济。因此，开发一种准确、快速的检测方法，对于净化蜂胶市场，加强对食品安全的监督和监控，尤为紧要。目前，HPLC/Q-TOF-MS可以广泛运用中药化学成分的快速鉴定定性分析，它可以使样品的分离和定性及定量成为一个连续的过程，能够在短时有效成分分离的基础上，获得大量的化合物结构信息，在中药化学成分分析中发挥了重要的作用，但蜂胶中的成分目前尚无利用HPLC/Q-TOF-MS检测的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种蜂胶中二十种多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，具有快速、高通量、高精度和高可靠性等优势，有利于进一步制定蜂胶提取物的质量监控标准。本专利技术是通过如下的技术方案予以实现的：一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其方法如下：（1）样品前处理：①取蜂胶原料，加入乙醇，超声处理，超声后取上清液用滤纸过滤，收集过滤清液和残留杂质；取残留杂质加入乙醇至浸润，超声处理后过滤，收集过滤清液和残留杂质，再重复此过程一次；合并过滤清液，蒸发回收，再采用烘箱烘烤干燥直至恒重，得到蜂胶乙醇提取物，随后将蜂胶乙醇提取物保存于冰箱直至使用；②取蜂胶乙醇提取物用乙醇配制成5mg/ml的储备液；（2）利用HPLC/Q-TOF-MS技术进行定性和定量分析：采用HPLC/Q-TOF-MS，取多酚类标准物共二十种，分别在指定色谱质谱条件测定每种多酚类标准物，得到每种多酚类标准物的准分子离子质量数，与现有多酚类标准物的理论精确质量数对比，确定每种多酚类标准物的离子化形式，将每种多酚类标准物的保留时间、离子化形式、分子式、CAS号和准确质量数信息导入PCDL软件形成多酚类物质数据库；将（1）②储备液制得的储备液稀释得蜂胶样品，按指定液相色谱条件采用HPLC/Q-TOF-MS测定蜂胶样品，根据建立的多酚类物质数据库，自动匹配保留时间、准确质量数，鉴别蜂胶样品中存在的多酚类物质，通过标准曲线法进行外标法定量，确定蜂胶样品中二十种多酚类物质含量。上述一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其中，步骤（1）①中乙醇的体积百分比浓度为95%，蜂胶原料与乙醇的质量体积比为1/（7.5~10）(g/ml)。上述一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其中，步骤（1）①中超声处理的时间为3h，温度为40℃，超声频率为600KHz，超声功率600W。上述一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其中，步骤（1）①中蒸发回收步骤采用50℃减压旋转蒸发仪，冰箱温度为-20℃。上述一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其中，步骤（2）所述HPLC/Q-TOF-MS的液相色谱条件如下：液相色谱系统为Agilent1200系列；液相色谱系统：采用Agilent1200系列；色谱柱：AgilentPoroshell120EC-C18柱；柱温：30℃；进样量：2μL；流速为：0.2ml/min。上述一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其中，所述HPLC/Q-TOF-MS的液相色谱条件中流动相：A相：水；B相：甲醇；并按梯度洗脱程序运行，所述梯度洗脱程序为：按体积分数计，0min，85%A和15%B；2min，85%A和15%B；10min，70%A和30%B；25min，10%A和90%B；30min，10%A和90%B；30min，85%A和15%B；45min，85%A和15%B。上述一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其中，步骤（2）所述HPLC/Q-TOF-MS的质谱条件如下：质谱系统：Agilent6510ESI-Q-TOF；离子源：电喷雾离子源ESI（+）；毛细管电压：4.0kV；锥孔电压：65V；碰撞电压：135V；气体温度：350°C；干燥气流速：11L/min；雾化压力：40psi；荷质比范围：100-3,200m/z。上述一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其中，二十种多酚类物质标准物分别为香草酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、反式异阿魏酸、芦丁、3,4-二甲氧基肉桂酸、杨梅素、桑色素、槲皮素、短叶松素、木犀草素、山奈酚、高良姜黄素、松属素、咖啡酸苯乙酯、柯因、芹菜素、姜黄素。本专利技术的有益效果为：本专利技术以乙醇超声提取蜂胶的效率高且效果好，同时HPLC/Q-TOF-MS可以使蜂胶样品的分离和定性及定量成为一个连续的过程，能够在短时有效成分分离的基础上，获得大量的化合物结构信息，确定蜂胶样品中主要黄酮、酚酸等多酚类物质含量，为蜂胶提取物质量评价提供了一种手段，有利于进一步制定蜂胶提取物的质量监控标准，具有快速、高通量、高精度和高可靠性等优势，能够对蜂胶中主要多酚类物质进行准确筛查。附图说明图1为共20种多酚类物质的质谱总离子流（TIC）图。图2为图1中11号和12号峰的EIC图。图3为图1中17号和18号峰的EIC图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。实施例中所述4号滤纸为Whatman4号定性滤纸；PCDL软件为仪器系统自带软件；以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1：一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其方法如下：（1）样品前处理：①称取100g蜂胶，用研磨机研磨成粉状，加入1L体积浓度为95%的乙醇，在40℃下超声处理3h，超声频率600KHz，超声功率600W，超声后取上清液用4号滤纸过滤，收集过滤清液和残留杂质；取残留杂质加入体积浓度为95%的乙醇至浸润，超声处理3h后过滤，收集过滤清液和残留杂质，再重复此过程一次；合并三次过滤清液，采用50℃减压旋转蒸发仪蒸发回收，再采用烘箱烘烤干燥直至恒重，得到蜂胶乙醇提取物，随后将蜂胶乙醇提取物保存于-20℃冰箱直至使用；②取蜂胶乙醇提取物用乙醇配制成5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q‑TOF‑MS检测方法，其特征为，其方法如下：（1）样品前处理：①取蜂胶原料，加入乙醇，超声处理，超声后取上清液用滤纸过滤，收集过滤清液和残留杂质；取残留杂质加入乙醇至浸润，超声处理后过滤，收集过滤清液和残留杂质，再重复此过程一次；合并过滤清液，蒸发回收，再采用烘箱烘烤干燥直至恒重，得到蜂胶乙醇提取物，随后将蜂胶乙醇提取物保存于冰箱直至使用；②取蜂胶乙醇提取物用乙醇配制成5 mg/ml的储备液；（2）利用HPLC/Q‑TOF‑MS技术进行定性和定量分析：采用HPLC/Q‑TOF‑MS，取多酚类标准物共二十种，分别在指定色谱质谱条件测定每种多酚类标准物，得到每种多酚类标准物的准分子离子质量数，与现有多酚类标准物的理论精确质量数对比，确定每种多酚类标准物的离子化形式，将每种多酚类标准物的保留时间、离子化形式、分子式、CAS号和准确质量数信息导入PCDL软件形成多酚类物质数据库；将（1）②储备液制得的储备液稀释得蜂胶样品，按指定液相色谱条件采用HPLC/Q‑TOF‑MS测定蜂胶样品，根据建立的多酚类物质数据库，自动匹配保留时间、准确质量数，鉴别蜂胶样品中存在的多酚类物质，通过标准曲线法进行外标法定量，确定蜂胶样品中二十种多酚类物质含量。...

【技术特征摘要】
1.一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其特征为，其方法如下：（1）样品前处理：①取蜂胶原料，加入乙醇，超声处理，超声后取上清液用滤纸过滤，收集过滤清液和残留杂质；取残留杂质加入乙醇至浸润，超声处理后过滤，收集过滤清液和残留杂质，再重复此过程一次；合并过滤清液，蒸发回收，再采用烘箱烘烤干燥直至恒重，得到蜂胶乙醇提取物，随后将蜂胶乙醇提取物保存于冰箱直至使用；②取蜂胶乙醇提取物用乙醇配制成5mg/ml的储备液；（2）利用HPLC/Q-TOF-MS技术进行定性和定量分析：采用HPLC/Q-TOF-MS，取多酚类标准物共二十种，分别在指定色谱质谱条件测定每种多酚类标准物，得到每种多酚类标准物的准分子离子质量数，与现有多酚类标准物的理论精确质量数对比，确定每种多酚类标准物的离子化形式，将每种多酚类标准物的保留时间、离子化形式、分子式、CAS号和准确质量数信息导入PCDL软件形成多酚类物质数据库；将（1）②储备液制得的储备液稀释得蜂胶样品，按指定液相色谱条件采用HPLC/Q-TOF-MS测定蜂胶样品，根据建立的多酚类物质数据库，自动匹配保留时间、准确质量数，鉴别蜂胶样品中存在的多酚类物质，通过标准曲线法进行外标法定量，确定蜂胶样品中二十种多酚类物质含量。2.如权利要求1所述的一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其特征为，步骤（1）①中乙醇的体积百分比浓度为95%，蜂胶原料与乙醇的质量体积比为1/（7.5~10）(g/ml)。3.如权利要求1所述的一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其特征为，步骤（1）①中超声处理的时间为3h，温度为40℃，超声频率为600KHz，超声功率600W。4.如权利要求1所述的一种蜂胶中多酚类物质HPLC/Q-TOF-MS检测方法，其特征为，步骤（1）①中...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴黎明，仲延龙，沈井旺，张莉，梅婷，周娟，
申请(专利权)人：江苏江大源生态生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32