一种非天然人参皂苷Rd12及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种新的非天然人参皂苷Rd12(3‑O‑β‑D‑glucopyranosyl(1‑2)‑β‑D‑glucopyranosyl‑12‑O‑β‑D‑glucopyranosyl‑protopanaxadiol)及其制备方法和应用，本发明专利技术以廉价的蔗糖为葡萄糖糖基供体，利用糖基转移酶和蔗糖合成酶作为偶联催化剂，以人参皂苷Rg3为糖基受体，以廉价的蔗糖为糖基供体，高效催化人参皂苷Rg3的C12位羟基糖基化生产非天然人参皂苷Rd12，具有专一性好、催化效率高、产物纯化简单等特点。另外，本发明专利技术制备的非天然人参皂苷Rd12可作为抗肿瘤药物，非天然人参皂苷Rd12对结肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞和胃癌细胞有显著的抑制作用。

A non natural ginsenoside Rd12 and its preparation and Application

The invention relates to a new non natural ginsenoside Rd12 (3 O glucopyranosyl (D beta 1 beta 2) D glucopyranosyl 12 O glucopyranosyl protopanaxadiol D beta) and its preparation and application, the invention uses cheap sucrose into glucose glycosyl donor use, glycotransferases and sucrose synthase as coupling catalyst, with ginsenoside Rg3 as a glycosyl acceptor, with cheap sucrose as glycosyl donor, catalyze the ginsenoside Rg3 C12 hydroxy glycosylation production of non natural ginsenoside Rd12, good specificity, high efficiency, catalytic purification of simple features with. In addition, the non natural ginsenoside Rd12 prepared by the invention can be used as an antineoplastic agent. The non natural ginsenoside Rd12 has a significant inhibitory effect on colon cancer cells, liver cancer cells, lung cancer cells and gastric cancer cells.

【技术实现步骤摘要】
一种非天然人参皂苷Rd12及其制备方法和应用
本专利技术属于生物技术和植物学
，涉及一种非天然人参皂苷Rd12及其制备方法和应用，具体涉及一种利用糖基转移酶和蔗糖合成酶偶联反应催化人参皂苷Rg3生成非天然人参皂苷Rd12的方法及应用。
技术介绍
人参(PanaxginsengC.A.Mayer)为五加科人参属中重要的药用植物，主要分布于我国东北部的长白山地区以及日本、韩国、朝鲜等东亚国家；作为传统中药，其在中国已使用有几千年，《神农本草经》记载人参具有“主补五脏、安神、定魂魄、止惊悸、除邪气、名目、”等多种功效。因此，人参冠有“百草之王”的美誉。人参皂苷是人参的主要活性成分，是由苷元与不同的糖基连接构成的糖苷类化合物。根据苷元的不同，可将人参皂苷分为原人参二醇型人参皂苷、原人参三醇型人参皂苷和齐墩果酸型人参皂苷三大类。原人参二醇型人参皂苷主要包括Rh2、CK、F2、Rg3、Rd等，其结构特点是糖基分别或者同时连接在原人参二醇骨架的C3-OH和C20-OH位置，而原人参二醇的C12-OH则没有糖基连接；C3-OH和C20-OH连接的糖基数目、种类以及糖基连接方式的不同对原人参二醇型人参皂苷结构以及药理活性多样性的形成至关重要。糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT，EC2.4.1.X)催化的糖基化反应是人参皂苷生物合成途径中最后一步修饰作用，通过糖基化作用可以生产许多不同结构以及药理活性的人参皂苷。与植物来源糖基转移酶相比，微生物来源的糖基转移酶具有催化活性高、底物谱广、区域选择性差等特点。因此，从微生物中挖掘新的具有独特催化活性和区域选择性的糖基转移酶并用于人参皂苷的糖基化修饰将有助于合成新的并且具有独特药理活性的人参皂苷。体外糖基化反应具有催化效率高、底物耐受性好、产物纯化简单等特点，但是，体外糖基化反应需要使用价格昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖,UDPG)作为糖基供体。蔗糖合成酶(Sucrosesynthase，SuSy，EC2.4.1.13)可以高效催化廉价的蔗糖与尿苷二磷酸(UDP)反应生成尿苷二磷酸葡萄糖和果糖；另外，蔗糖合成酶和糖基转移酶还可用于双酶偶联反应，蔗糖合成酶合成的尿苷二磷酸葡萄糖可作为糖基转移酶催化糖基化反应的糖基供体；同时，糖基转移酶催化糖基化反应生成的尿苷二磷酸又可用作蔗糖合成酶合成尿苷二磷酸葡萄糖的原料。因此，在糖基转移酶和蔗糖合成酶双酶偶联反应体系中，只需加入少量的尿苷二磷酸和较高浓度的廉价蔗糖即可以实现昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖的循环再生，从而可以以廉价的蔗糖为葡萄糖基供体，高效催化底物的糖基化修饰。
技术实现思路
本专利技术提供一种非天然人参皂苷Rd12及其制备方法和应用，通过所述方法，将糖基转移酶Bs-YjiC与蔗糖合成酶偶联，从而实现以廉价的蔗糖为葡萄糖糖基供体，以人参皂苷Rg3为糖基受体，高效催化人参皂苷Rg3的C12位羟基糖基化制备非天然人参皂苷Rd12的方法。第一方面，本专利技术提供一种非天然人参皂苷Rd12(3-O-β-D-glucopyranosyl(1-2)-β-D-glucopyranosyl-12-O-β-D-glucopyranosyl-protopanaxadiol)，所述非天然人参皂苷Rd12具有式I所示结构：本专利技术中，非天然人参皂苷Rd12是由人参皂苷Rg3底物的C12位羟基糖基化生成，其相比于其它人参皂苷，人参皂苷Rd12水溶性更好，稳定性更高、生物吸收性更好。第二方面，本专利技术提供一种制备如第一方面所述的非天然人参皂苷Rd12的催化体系，所述催化体系包括人参皂苷Rg3、蔗糖、蔗糖合成酶、糖基转移酶和尿苷二磷酸。本专利技术中，蔗糖合成酶和糖基转移酶可用于双酶偶联反应，蔗糖合成酶合成的UDP-葡萄糖可作为糖基转移酶催化糖基化反应的糖基供体；同时，糖基转移酶催化底物糖基化反应生成的副产物UDP又可用作蔗糖合成酶合成UDP-葡萄糖的原料。因此，在糖基转移酶/蔗糖合成酶双酶偶联反应中，只需加入少量的UDP和较高浓度的廉价蔗糖即可以实现UDP-葡萄糖的循环再生。优选地，可用于本专利技术的糖基转移酶为糖基转移酶Bs-YjiC，所述糖基转移酶Bs-YjiC的编码基因来源于枯草芽孢杆菌和/或其突变体，所述糖基转移酶Bs-YjiC的氨基酸序列如SEQIDNO.1或与其具有85％同源性，优选95％同源性的氨基酸序列。所述SEQIDNO.1的氨基酸序列如下：本专利技术中，与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有至少85％同源性，优选95％同源性且具有糖基转移酶酶活性的由SEQIDNO.1衍生的多肽，其中所述的衍生多肽还包括将所述的氨基酸序列添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。蔗糖合酶(sucrosesynthase，SuSy，EC2.4.1.13)是植物中糖类代谢的关键酶，植物光合作用产生的糖通常以淀粉的形式储存，SuSy在这个过程中发挥关键作用。SuSy为可逆反应酶，既可以催化一分子UDP-葡萄糖和一分子果糖合成一分子蔗糖和一分子UDP，继而合成淀粉，又可以催化一分子蔗糖和UDP反应生成一分子UDP-葡萄糖和果糖。可用于本专利技术的蔗糖合酶没有特别限制，可以为来源于各种植物或者微生物的、具有催化蔗糖与UDP原位合成UDP-葡萄糖功能的蔗糖合酶。通常，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆、亚硝酸单胞菌或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合，优选为拟南芥、大豆或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合，所述蔗糖合成酶为蔗糖合成酶AtSuSy；根据本专利技术，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2-6中的任意一种或与SEQIDNO.2-6中的任意一种具有85％同源性，优选95％同源性的氨基酸序列；所述SEQIDNO.2(拟南芥)的氨基酸序列如下：MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非天然人参皂苷Rd12，其特征在于，所述非天然人参皂苷Rd12具有式I所示结构：

【技术特征摘要】
1.一种非天然人参皂苷Rd12，其特征在于，所述非天然人参皂苷Rd12具有式I所示结构：2.一种制备如权利要求1所述非天然人参皂苷Rd12的催化反应体系，其特征在于，所述催化反应体系包括人参皂苷Rg3、蔗糖、蔗糖合成酶、糖基转移酶和尿苷二磷酸。3.根据权利要求2所述的催化反应体系，其特征在于，所述糖基转移酶为糖基转移酶Bs-YjiC；优选地，所述糖基转移酶Bs-YjiC的编码基因来源于枯草芽孢杆菌和/或其突变体；优选地，所述糖基转移酶Bs-YjiC的氨基酸序列如SEQIDNO.1或与其具有85％同源性，优选95％同源性的氨基酸序列。4.根据权利要求2所述的催化体系，其特征在于，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆、亚硝酸单胞菌或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合，优选为拟南芥、大豆或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2-6中的任意一种或与SEQIDNO.2-6中的任意一种具有85％同源性，优选95％同源性的氨基酸序列；优选地，所述蔗糖合成酶的为来自拟南芥的蔗糖合成酶AtSuSy，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；优选地，所述糖基转移酶的浓度为10-1000mU/mL，优选为16...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙媛霞，戴隆海，李娇，杨建刚，门燕，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12