鳖甲活性多肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了鳖甲活性多肽的制备方法，包括：脱脂、碱溶、酶解、纯化，以石油醚对鳖甲粉进行脱脂，脱脂粉经碱溶并离心后制得鳖甲蛋白粉，以复合蛋白酶对鳖甲蛋白粉进行酶解，经醋酸纤维微孔滤膜对酶解液抽滤后以超滤膜过滤得鳖甲活性多肽。有益效果为：酶解体系中加入（2R，4R）‑戊二醇可以降低酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，降低了时间成本；通过抽滤与超滤，将酶解产物中的寡肽与多肽分隔成四个不同的分子段，不仅避免了活性多肽的浪费，还实现了鳖甲的高效率利用。

Method for preparing turtle polypeptides

【技术实现步骤摘要】
鳖甲活性多肽的制备方法
本专利技术涉及活性多肽的制备领域，尤其是涉及鳖甲活性多肽的制备方法。技术背景鳖甲为鳖科动物鳖的背甲。鳖多生活于湖泊、小河及池溏旁的沙泥里，6-7月间产卵。分布很广，由东北至海南岛以及湖北、安徽、四川、云南、陕西、甘肃等地均有。主产湖北、安徽、江苏、河南、湖南、浙江、江西等地。此外，四川、福建、陕西、甘肃、贵州亦产。以湖北、安徽二省产量最大。全年均可捕捉,以秋、冬二季为多，捕捉后杀死，置沸水中烫至背甲上的硬皮能剥落时，取出，剥取背甲，除去残肉，晒干。鳖甲呈椭圆形或卵圆形，背面隆起，长10-15cm，宽9-14cm。外表面黑褐色或墨绿色，略有光泽，具细网状皱纹及灰黄色或灰白色斑点，中间有一条纵棱，两侧各有左右对称的横凹纹8条，外皮脱落后，可见锯齿状嵌接缝。内表面类白色，中部有突起的脊椎骨，颈骨向内卷曲，两侧各有肋骨8条，伸出边缘。质坚硬。气微腥，味淡。鳖甲具有滋阴潜阳，退热除蒸，软坚散结之功效。常用于阴虚发热、骨蒸劳热、阴虚阳亢、头晕目眩、虚风内动、经闭、癥瘕、久疟、疟母。关于鳖甲活性多肽的制备技术有很多方法，现有技术如授权公众号为CN103705907B的中国专利技术专利，公开了一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法及应用，鳖甲经水煎煮提取，提取液用蒸馏水稀释至相当于含鳖甲药材4-8g/100mL的浓度，分别采用微滤、多级超滤得到超滤液，减压浓缩，冷冻干燥得到分子量小于6KD的冻干粉，具有制备简单、可规模化生产的优点，但是该专利技术方法仅仅是加水煎煮然后经浸提、微滤、超滤，仅仅得到分子量小于6KD的多肽组分，对鳖甲活性物质造成了浪费。专利
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供鳖甲活性多肽的制备方法，鳖甲活性多肽的制备方法简单易行，将鳖甲活性多肽在多个分子段进行分离，鳖甲活性多肽得率较高。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：鳖甲活性多肽的制备方法，包括：脱脂、碱溶、酶解、纯化，具体包括以下步骤：脱脂：将鳖甲清理干净后烘干，粉碎后过120-160目筛，在鳖甲粉中加入2-3倍的石油醚，在35-37℃静置过夜后倒出石油醚，取不溶物水洗4-6次后得脱脂鳖甲粉；以石油醚脱去鳖甲中多余的脂肪，提高蛋白质的提取效率，同时可以回收石油醚中的脂肪，即回收利用了石油醚，又实现了鳖甲的全效利用；碱溶：按料液比1：3-5将脱脂鳖甲粉加入到蒸馏水中，采用0.1-0.3mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH为12.8-13.2，然后在冰浴中采用高速分散机匀浆5-15分钟，0-4℃条件下置于磁力搅拌器上搅拌1.5-2.0小时，在0-4℃温度下以10000-12000r/min离心15-18分钟，收集上清液，低温干燥得鳖甲蛋白粉；在高碱度条件下将绝大部分蛋白质溶解，去除不溶物，为进一步的提取鳖甲多肽做准备；酶解：取鳖甲蛋白粉按照料液比1:3.5-4.0溶解于蒸馏水中，加入鳖甲蛋白粉重量2.3-2.7%的复合蛋白酶酶解，加入复合蛋白酶重量18-24‰的（2R，4R）-戊二醇，酶解结束后灭酶得酶解液，将酶解液在3000-5000r/min离心机上离心10-20分钟取上清液；以复合蛋白酶可以将鳖甲蛋白酶解为活性多肽，酶解更彻底，酶解体系中加入（2R，4R）-戊二醇可以降低酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，降低了时间成本；纯化：用直径为50-100mm、孔径为0.35-0.45mm的醋酸纤维微孔滤膜对酶解步骤后的上清液进行抽滤，除去酶解液中的较粗颗粒；然后用超滤装置让酶解液依次通过30KD、10KD、3KD的超滤膜，收集>30KD、10-30KD、3-10KD、<3KD的四个分子段的酶解液，分别低温干燥后置于-80~-100℃低温冷藏；通过抽滤与超滤，将酶解产物中的寡肽与多肽分隔成四个不同的分子段，不仅避免了鳖甲活性多肽的浪费，还实现了鳖甲的高效率利用。作为优选，复合蛋白酶为重量比为4-6:1的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合物；使用复合蛋白酶酶解，可以发挥两种酶的协同作用，提高酶解效率。作为优选，酶解的pH为7.8-8.5，酶解温度为55-60℃，酶解时间为45-60分钟。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1）以复合蛋白酶可以将鳖甲蛋白酶解为活性多肽，酶解更彻底，酶解体系中加入（2R，4R）-戊二醇可以降低酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，降低了时间成本；2）通过抽滤与超滤，将酶解产物中的寡肽与多肽分隔成四个不同的分子段，不仅避免了活性多肽的浪费，实现了鳖甲的高效率利用。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：鳖甲活性多肽的制备方法，包括以下步骤：1）将鳖甲清理干净后烘干，粉碎后过120目筛，在鳖甲粉中加入2倍的石油醚，在35℃静置过夜后倒出石油醚，取不溶物水洗4次后得脱脂鳖甲粉；2）按料液比1：3将脱脂鳖甲粉加入到蒸馏水中，采用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH为12.8，然后在冰浴中采用高速分散机匀浆5分钟，0℃条件下置于磁力搅拌器上搅拌1.5小时，在0℃温度下以10000r/min离心15分钟，收集上清液，低温干燥得鳖甲蛋白粉；3）取鳖甲蛋白粉按照料液比1:3.5溶解于蒸馏水中，加入鳖甲蛋白粉重量2.3%的复合蛋白酶酶解，加入复合蛋白酶重量18‰的（2R，4R）-戊二醇，酶解结束后灭酶得酶解液，将酶解液在3000r/min离心机上离心10分钟取上清液；4）用直径为50mm、孔径为0.35mm的醋酸纤维微孔滤膜对酶解步骤后的上清液进行抽滤，除去酶解液中的较粗颗粒；然后用超滤装置让酶解液依次通过30KD、10KD、3KD的超滤膜，收集>30KD、10-30KD、3-10KD、<3KD的四个分子段的酶解液，分别低温干燥后置于-80℃低温冷藏；通过抽滤与超滤，将酶解产物中的寡肽与多肽分隔成四个不同的分子段，不仅避免了鳖甲活性多肽的浪费，还实现了鳖甲的高效率利用。实施2：鳖甲活性多肽的制备方法，包括以下步骤：1）脱脂：将鳖甲清理干净后烘干，粉碎后过160目筛，在鳖甲粉中加入3倍的石油醚，在37℃静置过夜后倒出石油醚，取不溶物水洗6次后得脱脂鳖甲粉；以石油醚脱去鳖甲中多余的脂肪，提高蛋白质的提取效率，同时可以回收石油醚中的脂肪，即回收利用了石油醚，又实现了鳖甲的全效利用；2）碱溶：按料液比1：5将脱脂鳖甲粉加入到蒸馏水中，采用0.3mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH为13.2，然后在冰浴中采用高速分散机匀浆15分钟，4℃条件下置于磁力搅拌器上搅拌2.0小时，在4℃温度下以12000r/min离心18分钟，收集上清液，低温干燥得鳖甲蛋白粉；在高碱度条件下将绝大部分蛋白质溶解，去除不溶物，为进一步的提取鳖甲多肽做准备；3）酶解：取鳖甲蛋白粉按照料液比1:4.0溶解于蒸馏水中，加入鳖甲蛋白粉重量2.7%的复合蛋白酶酶解，复合蛋白酶为重量比为4:1的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶，加入复合蛋白酶重量24‰的（2R，4R）-戊二醇，pH为7.8，温度为55℃，酶解时间为45分钟，酶解结束后灭酶得酶解液，将酶解液在5000r/min离心机上离心20分钟取上清液；以复合本文档来自技高网...

【技术保护点】
鳖甲活性多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：脱脂：将鳖甲清理干净后烘干，粉碎后过120‑160目筛，在鳖甲粉中加入石油醚，静置过夜后倒出石油醚，取不溶物水洗4‑6次后得脱脂鳖甲粉；碱溶：按料液比1：3‑5将脱脂鳖甲粉加入到蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，然后在冰浴中采用高速分散机匀浆5‑15分钟，0‑4℃条件下置于磁力搅拌器上搅拌1.5‑2.0小时，在0‑4℃温度下以10000‑12000r/min离心15‑18分钟，收集上清液，低温干燥得鳖甲蛋白粉；酶解：取鳖甲蛋白粉按照料液比1:3.5‑4.0溶解于蒸馏水中，加入复合蛋白酶酶解、（2R，4R）‑戊二醇，酶解结束后灭酶得酶解液，将酶解液在3000‑5000r/min离心机上离心10‑20分钟取上清液；纯化：用醋酸纤维微孔滤膜对酶解步骤后的上清液进行抽滤，除去酶解液中的较粗颗粒；然后用超滤装置让酶解液依次通过30KD、10KD、3KD的超滤膜，收集>30KD、10‑30KD、3‑10KD、<3KD的四个分子段的酶解液，分别低温干燥后置于‑80~‑100℃低温冷藏。

【技术特征摘要】
1.鳖甲活性多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：脱脂：将鳖甲清理干净后烘干，粉碎后过120-160目筛，在鳖甲粉中加入石油醚，静置过夜后倒出石油醚，取不溶物水洗4-6次后得脱脂鳖甲粉；碱溶：按料液比1：3-5将脱脂鳖甲粉加入到蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，然后在冰浴中采用高速分散机匀浆5-15分钟，0-4℃条件下置于磁力搅拌器上搅拌1.5-2.0小时，在0-4℃温度下以10000-12000r/min离心15-18分钟，收集上清液，低温干燥得鳖甲蛋白粉；酶解：取鳖甲蛋白粉按照料液比1:3.5-4.0溶解于蒸馏水中，加入复合蛋白酶酶解、（2R，4R）-戊二醇，酶解结束后灭酶得酶解液，将酶解液在3000-5000r/min离心机上离心10-20分钟取上清液；纯化：用醋酸纤维微孔滤膜对酶解步骤后的上清液进行抽滤，除去酶解液中的较粗颗粒；然后用超滤装置让酶解液依次通过30KD、10KD、3KD的超滤膜，收集&gt;30KD、10-30KD、3-10KD、&lt;3KD的四个分子段的酶解液，分别低温干燥后置于-80~-100℃低温冷藏。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：董珊珊，
申请(专利权)人：海盐县凌特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33