建立天然药物药理基因表达差异谱的方法并应用于药物筛选技术

一种建立天然药物药理基因表达差异谱的方法，它克服了现有技术中从分子学水平只能对非系统类疾病进行研究的缺陷。本发明专利技术是在建立动物模型之后，分离两组动物模型的肝脏、肾脏、脾脏、心肌、肺叶、脑组织、动静脉大血管、横纹肌、胰腺、肠组织和胃组织，通过基因芯片技术寻找相关疾病的靶组织，最后再通过基因芯片技术建立天然药物药理基因表达差异谱。用本发明专利技术可以从基因表达的分子学水平阐明各种疾病致病的机理。可以通过本发明专利技术进行天然药物药理的研究，从而进行天然药物新药的筛选。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种建立基因表达差异谱的方法，特别是建立一种天然药物药理基因表达差异谱的方法并应用于药物筛选。
技术介绍
基因表达谱是指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库，大规律cDNA测序，收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体，描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息，这样编制成的数据表就称为基因表达谱。近年来，人们相继开展了一系列大规模基因表达检测技术，人们已经能定性、定量且大规模地检测基因的表达产物mRNA，并绘制基因表达谱。在现有技术中，基因表达谱与药物治疗机理无关。现行中药的作用机理研究中，所用的常规方法皆为西药的药理研究方法。其特点是单一分子针对某种单一病机，或称单分子针对单靶点。而中药大多是多成分组成的复方药物，其药理作用是多靶点。显然用常规的药理学方法来研究中药是极不科学和合理，在《药学学报》1998，33(11)876～879“药物筛选的发展与现状”中报道人类靠自身试验进行药物筛选，受到多种因素的限制，特别是毒性反应是用人体筛选药物过程中很难避免的巨大困难。因此，使用动物进行药物筛选就被人们所采用，古代文献中就有用动物进行药物毒性观察的大量记载。但人类有目的、有计划地应用动物进行药物筛选，是现代医学发展的结果。实验动物的应用，使药物研究产生又一次飞跃，发现了大量新型药物，如抗高血压药和其它心血管系统药物的大量发现，就与应用动物进行筛选分不开的。直到本世纪70年代中期，动物实验一直是药物筛选的基本方法。但由于动物实验需要时间长、劳动强度大、操作技术要求高、受试样品需要量大(约5g)等因素的限制，因而发展缓慢，未能进行大规模筛选。而天然药物组成复杂，尤其是中药无法在分子水平进行药理研究。
技术实现思路
本专利技术的目的正是为了克服上述现有技术中的不足之处，提供将祖国将传统中医理论和现代生物分子知识紧密相结合，从而建立一种天然药物药理基因表达差异谱的方法并应用于药物筛选。为达到上述目的，本专利技术提供了的方法包括如下步骤(1)建立两组动物模型一组为正常组，一组为疾病模型组；(2)寻找疾病相关靶组织分离两组动物模型的肝脏、肾脏、脾脏、心肌、肺叶、脑组织、动静脉大血管、横纹肌、胰腺、肠组织和胃组织，提取两组动物组织中的总RNA，逆转录，制备探针，杂交，芯片扫描，数据分析，凡疾病模型组与正常组相同组织的基因表达无差异的组织剔除，基因表达有差异的组织即为疾病相关靶组织；(3)建立天然药物药理基因表达差异谱将待测天然药物按方剂的高剂量，中剂量和低剂量，分三组给疾病动物模型组，给药形成三个剂量的“疾病给药”组，将疾病动物模型给等容量生理盐水形成“疾病对照”组，将正常动物模型给等容量生理盐水形成“正常对照”组，常规疗程后，分离上述五个组的疾病相关靶组织，提取RNA，逆转录，制备探针，杂交，芯片扫描，数据分析；依据正常对照-疾病对照-疾病给药三种情况下高剂量、中剂量或低剂量的，在疾病相关靶组织中，疾病相关基因的表达差异而形成的图谱即为天然药物药理基因表达差异谱。本专利技术能将所建立的天然药物药理基因表达差异谱应用于天然药物药理的研究和天然药物的筛选。本专利技术的优点是1、可以对所用病症从基因表达的分子学水平阐明各种疾病致病的机理。2、可以进行天然药物药理的研究。克服了现行中药的作用机理研究中，只能用西药的药理研究方法。而又无法将西药的单一分子针对某种单一病机，或称单分子针对单靶点应用于解决中药大多是多成分组成的复方药物，其药理作用是多靶点的问题。3、可以通过本专利技术进行天然药物药理的研究，当众多异常基因表达在天然药物的作用下趋于正常表达时，该天然药物就显然是有疗效的。从而进行天然药物新药的筛选。药理学研究不但是药物作用机理的研究，同时也是药物筛选的依据及方法。4、利用已知药物(疗效确切的药物)建立的药理基因表达差异谱，可知道疗效与靶组织中相关基因表达的定性、定量关系，利用此关系就可以对待筛药物有无疗效及疗效强弱做判断，而筛选新药。附图说明图1是利用本专利技术建立的高血压天然药物药理基因表达差异谱。图2是利用本专利技术建立的II型糖尿病天然药物药理基因表达差异谱。(1)建立高血压的动物模型。将试验小鼠分为两组，即正常组和模型组，正常组12只，模型组30只，模型小鼠喂养高糖、高蛋白饲料，使之形成原发性高血压模型，正常组小鼠给予普通饲料，两组动物均自由饮水。(2)寻找原发性高血压的相关靶组织。造模成功后处死正常组中的6只小鼠和模型组中的6只小鼠，分离动物的肾脏、肝脏、脾脏、心肌、肺(肺叶)、动静脉大血管、横纹肌、脑组织、胰腺、肠组织和胃组织，将正常组和模型组中每6只动物组各个组织合并，提取总RNA，将RNA制备成RNA探针，用每张芯片含8000个以上基因、数目为2×11张的Oligo芯片杂交，杂交芯片扫描，数据分析。比较模型组和正常组小鼠上述组织的基因表达差异，相同表达的组织剔除，表达有差异的组织为心肌、动静脉大血管，肾脏，即这些组织为原发性高血压的相关靶组织。(3)建立治疗高血压天然药物的药理基因表达差异谱取已造模成功的小鼠18只，随机分为3组，每组6只，分别为KH-012号天然药物方剂的高剂量组(12g/kg)，中剂量组(6g/kg)和低剂量组(3g/kg)，另取6只给予等容量生理盐水，为模型对照组，最后取6只正常小鼠，给予等容量生理盐水，为正常对照组。给药时间均为7天，处死全部动物，取出高血压相关靶组织，即心肌、动静脉大血管，肾脏，按前述方法进行RNA提取，制备探针，杂交，扫描，数据分析。依据正常对照-疾病对照-疾病给药三种情况下三个剂量的，在高血压相关靶组织中，疾病相关基因的表达差异而形成的图谱，如图1所示的是KH-012号治疗高血压天然药物高剂量组的药理基因表达差异谱。实施例2(1)建立针对II型糖尿病病因的小鼠动物模型。将实验小鼠分为两组，即正常组和模型组，正常组12只，模型组30只。模型组小鼠喂养高糖、高脂饲料，使之形成II型糖尿病模型，喂养时间100天，正常组小鼠给予普通饲料，两组动物均自由饮水。(2)寻找II型糖尿病相关靶组织。100天后测定模型组小鼠和正常组小鼠的血糖值，胰岛素含量，以确认造模成功。处死正常组中6只小鼠和模型组中6只小鼠，分离动物的肾脏、肝脏、脾脏、心肌、肺(肺叶)、动静脉大血管、横纹肌、脑组织、胰腺、肠组织和胃组织，将正常组和模型组中每6只动物组各个组织合并，提取总RNA，将RNA制备成RNA探针，用每张芯片含8000个以上基因、数目为2×11张的Oligo芯片杂交，杂交芯片扫描，数据分析。比较模型组和正常组小鼠上述组织的基因表达差异，相同表达的组织剔除，表达有差异的组织为横纹肌、胰腺，即这些组织为II型糖尿病的相关靶组织。(3)治建立治疗II型糖尿病天然药物的药理基因表达差异谱取已造模成功的小鼠18只，随机分为3组，每组6只，分别为KH-054号天然药物方剂的高剂量组(12g/kg)，中剂量组(6g/kg)和低剂量组(3g/kg)，另取6只给予等容量生理盐水，为模型对照组，最后取6只正常小鼠，给予等容量生理盐水，为正常对照组。给药时间均为7天，处死全部动物，取出II型糖尿病相关靶组织，即横纹肌、胰腺，按前述方法进行RNA提取，制备探针，杂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立天然药物药理基因表达差异谱的方法，其步骤的特征在于： １．１建立两组动物模型：一组为正常组，一组为疾病模型组； １．２寻找疾病相关靶组织：分离两组动物模型的肝脏、肾脏、脾脏、心肌、肺叶、脑组织、动静脉大血管、横纹肌、胰腺、肠组织和胃组织，提取两组动物组织中的总ＲＮＡ，逆转录，制备探针，杂交，芯片扫描，数据分析，凡疾病模型组与正常组相同组织的基因表达无差异的组织剔除，基因表达有差异的组织即为疾病相关靶组织； １．３建立天然药物药理基因表达差异谱：将待测天然药物按方剂的高剂量，中剂量和低剂量，分三组给疾病动物模型组，给药形成三个剂量的“疾病给药”组，将疾病动物模型给等容量生理盐水形成“疾病对照”组，将正常动物模型给等容量生理盐水形成“正常对照”组，常规疗程后，分离上述五个组的疾病相关靶组织，提取ＲＮＡ，逆转录，制备探针，杂交，芯片扫描，数据分析；依据正常对照－疾病对照－疾病给药三种情况下高剂量、中剂量或低剂量的，在疾病相关靶组织中，疾病相关基因的表达差异而形成的图谱即为天然药物药理基因表达差异谱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郝晓锋，
申请(专利权)人：成都康弘科技实业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]