耐药菌检测芯片及其制备方法和应用方法技术

本发明专利技术属微生物检验领域，涉及一种常见耐药菌检测芯片及其制备方法和应用方法。本发明专利技术利用ＤＮＡ芯片的方法，将已经合成的用于检测临床常见耐药菌的寡核苷酸探针固定于载玻片表面形成点阵，通过将待测样本的ＤＮＡ片断与芯片杂交，可获取大量与细菌鉴定以及耐药性相关的基因序列信息，将临床标本中存在的常见致病细菌鉴定到菌种，从而同期实现临床常见致病菌的鉴定以及主要耐药谱的检测，本发明专利技术检测过程简便、快速，检测灵敏、特异，能明显缩短疾病的诊断时间，为感染性疾病患者的救治赢得宝贵时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属微生物检验领域，涉及耐药菌快速检测的方法，特别是一种常见。
技术介绍
近年发展起来的DNA芯片检测技术，利用或借助微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，可以快速、高效地获取或处理大量的生命信息(包括基因的识别、基因突变检测、基因表达谱检测和对外来分子的识别等)，在生物学研究如，生命科学、医学诊断、新药筛选和司法鉴定等研究中发挥了重要作用。当前，感染性疾病仍然是威胁人类健康和生命的重要疾病，据2003年世界卫生组织将健康报告，2002年全球62.25亿人口中，感染性疾病占死亡原因的第二位(26.2％)，仅次于心血管病(29.2％)，而在致残或劳动力丧失的原因中则高居榜首(30％)。感染性疾病治愈率低、病死率高的主要原因有以下两方面一是病原诊断不及时，未能早期正确进行抗感染治疗，二是细菌耐药性严重，治疗困难。临床医疗工作中，在未能明确病原前，常予以经验治疗，然而即使是基于循证医学拟定的经验治疗方案亦有较高的主观性和盲目性。在欧洲一个大系列临床调查结果发现对感染者的经验治疗方案属不恰当者占25％，属此种情况者由于抗感染治疗方案不正确导致42％～60％的病死率，而治疗方案正确者病死率仅17.7％。不恰当的治疗往往表现为滥用广谱抗菌药，其结果除疗效差外，尚导致耐药菌的明显增多，以致治疗更为困难，医疗费用亦大幅上升。造成临床上抗感染治疗不恰当的根本原因在于目前病原诊断水平低、费时间。以细菌而言，细菌检出及细菌药敏测定需4～5日，至少3日，血培养常需5～7日。感染病原菌耐药，又缺乏病原和药敏的资料，不能及时正确针对性抗感染治疗，是导致耐药菌感染治疗失败的主因。近年来，日益增多的耐药菌感染出现在细菌中，多重耐药的非发酵菌、肠杆菌科细菌和葡萄球菌感染逐年增多，以假单胞菌、不动杆菌等非发酵菌为例，已经自20世纪90年代的占革兰阴性杆菌的23％～25％至目前的约35％，且为重症监护室感染的第1、2位病原菌，常呈多重耐药，其所致肺部感染、血流感染的病死率可达20％～40％。此均给治疗带来了很大的困难。临床上重要的耐药菌在革兰阳性菌中是甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌和青霉素不敏感肺炎链球菌，而产β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌耐药的重要机制，其中最重要的机制之一是产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases，ESBLs)。研究报道，耐甲氧西林葡萄球菌的主要耐药机制是由于葡萄球菌胞膜上的青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)发生改变。耐甲氧西林葡萄球菌产生的青霉素结合蛋白称为PBP2a或PBP2’。由于PBP2a与β-内酰胺类抗生素的亲和力极低且能替代其它PBPs的功能，使得耐甲氧西林葡萄球菌能够在高浓度β-内酰胺类抗生素存在的环境中生存。编码PBPs的结构基因为mecA，该基因位于耐甲氧西林葡萄球菌的环状染色体上，受mec1和mecR1基因调控。耐万古霉素肠球菌的耐药机制主要是由于肠球菌携带了vanA、vanB、vanC、vanD、vanE等耐药基因后，细胞壁的生物合成途径发生了改变，使其合成的肽聚糖前体与万古霉素等糖肽类抗生素亲和力下降，从而导致肠球菌对万古霉素耐药。目前研究较多的是vanA、vanB、vanC。携带vanA的肠球菌对万古霉素及替考拉宁均高度耐药，而携带vanB的肠球菌对万古霉素呈不同程度的耐药，但对替考拉宁敏感，携带vanC的肠球菌对万古霉素低度耐药，对替考拉宁敏感，通常以前两者较为多见，最具临床意义。青霉素不敏感肺炎链球菌的耐药机制主要是由于编码PBPs的基因pbp1a，pbp2x和pbp2b发生变异，它们的编码产物与青霉素的亲和力下降，从而导致肺炎链球菌对青霉素耐药。该过程的发生，是一个上述3个基因逐步变异而导致耐药程度逐步提高，且存在多条变异途径的渐进过程，其中pbp2b的变异是高度耐药所必需的。ESBLs主要有TEM型、SHV型和CTX-M型、OXA型和其他型。TEM、SHV型是在广谱酶TEM-1、2、SHV-1的基础上发生1～5个氨基酸产生点突变而来，由于氨基酸的改变引起底物谱的扩大从而导致细菌对第三代头孢菌素和单环β-内酰胺类抗生素的耐药。SHV、TEM家族的组内同源性较高，与普通的广谱酶序列仅相差一至几个氨基酸，其中TEM家族在国内较少报道，CTX-M按基因序列同源性可分为4～5个组，组间同源性较低，均为ESBLs，是国内肠杆菌科细菌最常见的型别。传统的病原学诊断及其耐药性检测主要依赖于形态学、培养等方法，其成本相对较低，方法也不复杂。但最大的缺点在于耗时长，近年来虽然出现了快速培养的技术，但大大提高了成本，也难于在短时间内同时获取细菌鉴定与药敏试验数据，仍然不能满足临床需要。常用的耐药性检测方法有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、E-试验法等，这些方法均须在获得纯培养的细菌后才能进行，因此，耐药性检测在病原学检测基础上至少还需要增加一天的时间以获取结果。鉴于此，耐药菌的快速诊断成为临床微生物学的一个重要发展方向。分子生物学检测技术是以病原菌的核酸为研究对象，通过鉴定的病原和耐药基因的核酸分子来进行病原学诊断。如核酸杂交技术，靶基因的扩增技术等，但是这些技术共同的缺点在于能够检测的靶位点较少，实用性较差，有些技术需要进行RNA操作，技术复杂，操作要求高，在临床上难以推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述已有技术的不足，提供一种常见耐药菌检测芯片及其制备方法。本专利技术的进一步目的是提供耐药菌检测芯片的应用方法，以实现对临床常见致病细菌鉴定以及主要耐药性测定的敏感、特异、快速的检测。本专利技术利用DNA芯片的方法，将已经合成的用于检测常见耐药菌的寡核苷酸探针固定于载玻片表面形成点阵，通过将待测样本的DNA片断与芯片杂交，即可获取大量与细菌鉴定以及耐药性相关的基因序列信息，从而同期实现临床常见致病菌的鉴定以及主要耐药谱的检测，为感染病的治疗提供参考。本专利技术通过下述技术方案实现一种耐药细菌检测芯片，在一张经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针，其特征在于 (1)所说的探针是针对不同细菌23S rRNA基因特异序列及其主要耐药基因包括mecA基因、PBP2B基因、vanA基因、vanB基因、SHV基因和CTX-M基因的特异序列或突变位点而设计的；(2)每一探针的熔解温度(Tm)相近；(3)突变位点尽可能位于探针的中间；所说的探针主要针对23S rRNA基因，mecA基因，PBP2B基因，vanA基因，vanB基因，SHV基因，CTX-M基因。针对不同细菌23S基因各自特异序列设计的探针如表1所示表1.菌种检测探针序列编号探针序列1 通用探针NH2-poly(T)16-GACCGATAGTGAACCAGTACCG2 金葡菌 NH2-poly(T)16-CGGAGTTACAAAGGACGACAT3 葡萄球菌通用探针NH2-poly(T)16-GTAGGACACTCTATACGGAGAC4 肠球菌通用探针 NH2-poly(T)16-GAGGTAGACGCAGAGAACTGAA5 粪肠球菌NH2-poly(T)16-CGAAATGCTR(A/G)ACAACACCTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐药细菌检测芯片，在一张经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针，其特征在于：（１）所说的探针是针对不同细菌２３ＳｒＲＮＡ基因特异序列及其主要耐药基因包括ｍｅｃＡ基因、ＰＢＰ２Ｂ基因、ｖａｎＡ基因、ｖａｎＢ基因、ＳＨＶ 基因和ＣＴＸ－Ｍ基因的特异序列或突变位点设计的；（２）每一探针的熔解温度（Ｔｍ）相近；（３）突变位点尽可能位于探针的中间；。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林东昉，徐晓刚，毛红菊，赵建龙，赵辉，朱德妹，张婴元，汪复，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]