修饰的肌氨酸氧化酶,制备方法及其试剂组合物技术

修饰的肌氨酸氧化酶，其是一种在构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中通过添加、删除、插入或置换至少一个氨基酸而转化的蛋白质，特征为具有肌氨酸氧化酶活性和与转化前的蛋白相比具有改进的液体稳定性。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,制备方法及其试剂组合物的制作方法
本专利技术涉及通过以蛋白工程技术修饰具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白而得到的肌氨酸氧化酶，其特征在于具有在改进的液体稳定性，优异的底物特异性和对脯氨酸的作用降低，以及生产肌氨酸氧化酶的方法和使用其的试剂组合物。
技术介绍
肌氨酸氧化酶(EC 1.5.3.1)作为一种酶，与其他酶，如肌酐酶、肌酸酶和过氧化物酶一起用于检测体液内肌酸和肌酐，它们是诊断肌肉疾病和肾病的临床指示物。肌氨酸氧化酶在有水和氧气的情况下作用于作为底物的肌酸，产生甘氨酸、甲醛和过氧化氢。已知肌氨酸氧化酶通过芽孢杆菌属(Bacillus)(JP-54-52789-A，JP-61-162174-A)，棒状杆菌属(Corynebacterium)(J.Biochem.89599，1981)，柱孢属(cylindrocarpon)(JP-56-92790-A)，假单孢菌属(pseudomonas)(JP-60-43379-A)和节杆菌属(arthrobacter)(JP-2-265478-A)的细菌产生。利用例如带有通过基因工程技术从这些细菌获得的肌氨酸氧化酶基因的大肠杆菌宿主，大规模生产肌氨酸氧化酶的技术已经有报道(JP-5-115281-A，JP-6-113840-A，JP-8-238087-A)。伴随近来的液体临床诊断试剂，液体中试剂组分的各种稳定化方法已经被研究，并且对用作检测肌酐和肌酸试剂的肌氨酸氧化酶，一种在液体中具有优异的稳定性的酶是渴望得到的。我们小组之前曾报道通过蛋白工程方式修饰野生型肌氨酸氧化酶而改进其突变型对金属离子的稳定性(参见，如，JP-7-163341)，但考虑到诊断试剂的长期储存稳定性，还期待有更多的改进。此外，已知常规的肌氨酸氧化酶还对脯氨酸作用，其是出现在血液中的一种氨基酸，并已有指出它能导致在肌酐和肌酸测量时真实的或假的差异(Rinsho kagaku，20144-152，1991；Seibutsu Shiryo Bunseki，17332-337，1994)。为解决上述问题，我们小组报道了通过蛋白工程方式修饰野生型肌氨酸氧化酶而具有对脯氨酸作用降低的肌氨酸氧化酶(JP-10-248572-A)，但其对原始底物肌酸的作用还不清楚，还需要有更多的改进。本专利技术的目的是提供具有改进的液体稳定性的。本专利技术的另一个目的是提供具有对脯氨酸低反应性和具有优异的底物特异性的肌氨酸氧化酶。本专利技术的另一个目的是提供具有对脯氨酸作用降低的肌氨酸氧化酶。
技术实现思路
作为完成上述目的的广泛研究的结果，本专利技术人发现肌氨酸氧化酶经修饰后具有改进的液体稳定性或具有对脯氨酸的作用降低同时不破坏其对肌酸的作用。此外，本专利技术人发现肌氨酸氧化酶能被修饰以保持与肌酸的高亲和力和具有对脯氨酸的作用降低，因此完成本专利技术。换句话说，本专利技术由下列部分组成。，其是一种在构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中通过添加、删除、插入或置换至少一个氨基酸而转化的蛋白质，特征为具有肌氨酸氧化酶活性和与转化前的蛋白相比具有改进的液体稳定性。根据的，其特征在于构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。根据的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有与SEQ ID NO1的氨基酸序列50％或更多的同源性。根据的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有与SEQ ID NO1的氨基酸序列80％或更多的同源性。根据的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的155到250位的相应区域中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的82到92或354到366位的相应区域中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。根据的，其特征在于选自相应SEQ IDNO1氨基酸序列的89，155，166，204，213，233，240，250和364位中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的89位赖氨酸被精氨酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的155位半胱氨酸被异亮氨酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的166位天冬酰胺被赖氨酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的204位甲硫氨酸被丙氨酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的213位丝氨酸被脯氨酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的233位半胱氨酸被丝氨酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的240位天冬酰胺被酪氨酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的250位谷氨酸被谷氨酰胺替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的364位丙氨酸被缬氨酸替换。，其为一种在构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中通过添加、删除、插入或置换至少一个氨基酸而转化的蛋白质，特征为具有肌氨酸氧化酶活性和与转化前的蛋白相比对L-脯氨酸作用降低。根据的，其特征在于构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。根据的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有与SEQ ID NO1的氨基酸序列50％或更多的同源性。根据的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有与SEQ ID NO1的氨基酸序列80％或更多的同源性。根据的，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的82到152和216到328位的相应区域中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的82到97和313到328位的相应区域中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。根据的，其特征在于选自相应SEQID NO1氨基酸序列的89，94和322位中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的89位赖氨酸被精氨酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的94位缬氨酸被甘氨酸替换。根据的，其特征在于SEQ ID NO1氨基酸序列的322位赖氨酸被精氨酸替换。根据的，其特征在于修饰后肌氨酸氧化酶的Km值在未修饰酶的3倍以内。根据的，其特征在于修饰后肌氨酸氧化酶的Km值在未修饰酶的1.5倍以内。肌氨酸氧化酶，其特征在于37℃和pH8.0条件下测量具有至少下列一个特征对L-脯氨酸作用基于肌酸为0.7％或更低；和L-脯氨酸的Km值150mM或更多。根据的肌氨酸氧化酶，其特征在于37℃和pH8.0条件下测量具有至少下列一个特征对L-脯氨酸作用基于肌酸为0.5％或更低；和L-脯氨酸的Km值200mM或更多。根据的肌氨酸氧化酶，其中肌酸的Km值为10mM或更低。根据的肌氨酸氧化酶，其中肌酸的Km值为5mM或更低。编码到和到任一项的的基因。含有的基因的载体。转化有的载体的转化子。生产的方法，特征在于培养的转化子和从培养物中收集肌氨酸氧化酶。生产底物特异性优异的的方法，特征在于培养具有到任一项的肌氨酸氧化酶的生产能力的微生物和从培养物中收集肌氨酸氧化酶。含有到和到和到任一项的肌氨酸氧化酶的用于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：岸本高英，曾我部敦，冈正则，
申请(专利权)人：东洋纺织株式会社，
类型：发明
国别省市：