本发明专利技术公开了一种定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及检测试剂盒，本发明专利技术在原有肌氨酸氧化酶分光光度检测法的基础上，着重改善原有方法灵敏度不足以满足临床检测的缺点。选用目前检测灵敏度较高、稳定性较好的色原物质，使用双试剂检测法，合理分配各反应物质在整体反应体系中的浓度，检测吸光度数据读取时采用固定时间点读取法。使检测灵敏度较以往分光光度检测法大大提升。因此，使得本检测方法既保留了以往分光光度检测法成本低、可在全自动生化仪上使用的优点外，也改善其检测灵敏度低的缺点，使目前的检测灵敏度提升到10-7～10-6mol/L，已能满足临床检测的需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及检测试剂盒。
技术介绍
目前用于检测肌氨酸的方法主要有液相色谱或气象色谱与质谱联用检测法、肌氨酸氧化酶荧光检测法、毛细管电泳电化学发光检测法、肌氨酸氧化酶分光光度检测法。色谱-质谱联用检测法虽然检测灵敏度、准确度、精密度均较高，但由于色谱-质谱设备昂贵，检测成本较高，检测速度慢，很难大批量检测，且操作复杂一般人很难掌握。因此，常应用于科研，很难应用临床大样本量诊断检测。 肌氨酸氧化酶荧光检测法、毛细管电泳电化学发光检测法其检测灵敏度、准确度、精密度略低于色谱-质谱联用检测法，但也可满足临床的需求。此两种方法的检测成本较色谱-质谱联用检测法已大大降低，但在检测时仍需购置专门的检测装置，如荧光检测器、毛细光电泳仪等专门设备。并且人工操作的部分很高，对应用于常规临床检测来讲仍有一定的难度。肌氨酸氧化酶分光光度检测法，其检测成本低、可应用于目前任何一种全自动生化分析仪，可应用于临床高速大样本量的检测需要。但由于以往的色原灵敏度低，造成该方法的灵敏度很难满足临床的需求。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种成本低、灵敏度高的定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，本专利技术的另一目的是提供一种肌氨酸检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，具体为D肌氨酸+Η2θ+θ2議乂化》^甘氨酸+甲酸+H2O2;2)Η202+4-氨基安替比林+色原——— 醌亚胺类有色物质+H2O;反应结束后有醌亚胺类有色物质生成造成吸光度的变化，并且该吸光度的变化与肌氨酸的浓度成正比，以检测得到的样本吸光度值与校准曲线对比，得到相应的样本浓度数值；其中，一试剂Rl浓度为缓冲液50-100mmol/L，4-氨基安替比林2-4mmol/L，过氧化物酶>20KU/L ;二试剂R2浓度为缓冲液50-1OOmmoI/L，色原3-5mmol/L，肌氨酸氧化酶5-10KU/L ;R1/R2试剂比例为3/1-4/1，肌氨酸样本与总体试剂量的比例为1/25 1/20。进一步，所述缓冲液包括Tris-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液或N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，缓冲液PH值为7. (T9. O。进一步，所述色原包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3_甲基苯胺钠盐(TOOS)或N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)或N- (2-羟基-3-磺丙基)-3’ 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)。进一步，不同所述色原所采用的检测主波长不同，副波长均使用相同的700nm波长。进一步，所述TOOS所采用的检测主波长为550-570nm，所述TODB所采用的检测主波长为530-540nm，所述HDAOS所采用的检测主波长为580_590nm。进一步，所述步骤I)、2)反应温度为3(T40°C，反应时间控制在8-10分钟，吸光度监测点控制在加入R2试剂后3(Γ66秒开始监测反应吸光度值直至反应结束。一种用于实施上述非诊断性方法的肌氨酸检测试剂盒，包括的试剂及其浓度为一试剂 Rl 缓冲液50_100mmol/L ；4-氨基安替比林2_4mmol/L ; 过氧化物酶>20KU/L;二试剂 R2 缓冲液50-1OOmmo I/L ；色原3_5mmol/L ；肌氨酸氧化酶5-10KU/L。进一步，所述缓冲液包括Tr i s-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液或N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，缓冲液PH值为7. (T9. O。进一步，所述色原包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3_甲基苯胺钠盐(TOOS)或N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)或N- (2-羟基-3-磺丙基)-3’ 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)。本方法在原有肌氨酸氧化酶分光光度检测法的基础上，着重改善原有方法灵敏度不足以满足临床检测的缺点，使得本检测方法既保留了以往分光光度检测法成本低、可在全自动生化仪上使用的优点外，也改善其检测灵敏度低的缺点，使目前的检测灵敏度提升到10tl0_6mol/L，已能满足临床检测的需求(目前研究表明正常人肌氨酸水平10_6mol/L水平)。附图说明图I为实施例I中的校准曲线；图2为实施例I中的样本反应曲线；图3为实施例2中的校准曲线；图4为实施例3中的样本反应曲线。具体实施例方式下面，参考附图，对本专利技术进行更全面的说明，附图中示出了本专利技术的示例性实施例。然而，本专利技术可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本专利技术全面和完整，并将本专利技术的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。检测原理肌氨酸+H20+02 ■g—- 甘氨酸+甲酸+H2O2H202+4-氨基安替比林+色原■■■■■■■■■■ 醌亚胺类有色物质+H2O反应结束后有醌亚胺类有色物质生成造成吸光度的变化，并且该吸光度的变化与肌氨酸的浓度成正比。反应体系中各反应物质浓度试剂浓度Rl (一试剂)缓冲液50-100mmol/L 4-氨基安替比林2_4mmol/L过氧化物酶>20KU/LR2 (二试剂)缓冲液SOmmoI /I,色原3_5mmol/L肌氨酸氧化酶 5-10KU/L样本试剂反应体积比例R1/R2试剂比例为3/1，样本与总体试剂量的比例为1/5 1/20。缓冲液反应体系用缓冲液可以使Tris-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液、N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液。缓冲液PH值调整在7. O 9. O左右。5. 4色原，色原可选用目前的新型色原(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)或N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)或N-(2-羟基-3-磺丙基)_3’ 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDA0S))。检测波长不同色原所采用的检测主波长不同，副波长相同均使用700nm波长，TOOS 550-570nm ；TODB530_540nm ；HDAOS 580_590nm。反应温度最佳反应温度为30 40°C。反应时间与吸光度监测时间反应时间控制在8-10分钟，吸光度监测点控制在加入R2试剂后30 66秒开始监测反应吸光度值直至反应结束。实验步骤I、校准品配置使用肌氨酸纯品配制浓度为6. 25umol/L> 12. 5umol/L、25umol/L、50umol/L、100umol/L的溶液最为校准品溶液。2、空白吸光度值检测(AO ):I)吸取纯水溶液加入Rl试剂溶液,将两溶液混匀反应,开始监测反应时间，反应温度37 °C。2)待上述溶液反应3分钟后，加入R2试剂溶液，将溶液混匀反应，继续监测反应时间，反应温度37 C。3)待整体反应时间到达30 66秒后，以不同色原物质的最大吸收波长为主波长，以700nm波长为副波长，开始监测吸光度值记为A1=A1 ±-A1 ^继续监测反应时间，待整体反应结束后(8-10分钟)再次监测吸光度值记为A2=A2±-A2ffl。4)吸光度值计算=Aq=A2-Aiq3、校准品吸光度值检测(Asn):I)吸取校准品溶液加入Rl试剂溶液，将两溶液混匀反应，开始监测反应时间，反应温度37 °C。2)待上述溶液反应3分钟后，加入R2试剂溶液，本文档来自技高网...
【技术保护点】
定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，其特征在于，该方法具体为：1）2）反应结束后有醌亚胺类有色物质生成造成吸光度的变化，并且该吸光度的变化与肌氨酸的浓度成正比，以检测得到的样本吸光度值与校准曲线对比，得到相应的样本浓度数值；其中，一试剂R1浓度为：缓冲液50？100mmol/L，4？氨基安替比林2？4mmol/L，过氧化物酶>20KU/L；二试剂R2浓度为：缓冲液50？100mmol/L，色原3？5mmol/L，肌氨酸氧化酶5？10KU/L；R1/R2试剂比例为3/1？4/1，肌氨酸样本与总体试剂量的比例为1/25~1/20。FDA00002338318700011.jpg,FDA00002338318700012.jpg
【技术特征摘要】
1.定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法，其特征在于，该方法具体为 1)肌氨酸+H20+02-aa8M··__ 甘氨酸 + 甲酸+H2O2; 2)H202+4-氨基安替比林+色原-獲·- 醌亚胺类有色物质+H2O; 反应结束后有醌亚胺类有色物质生成造成吸光度的变化，并且该吸光度的变化与肌氨酸的浓度成正比，以检测得到的样本吸光度值与校准曲线对比，得到相应的样本浓度数值； 其中，一试剂Rl浓度为缓冲液50-100mmol/L，4-氨基安替比林2-4mmol/L，过氧化物酶>20KU/L ;二试剂R2浓度为缓冲液50-1OOmmoI/L，色原3-5mmol/L，肌氨酸氧化酶5-10KU/L ;R1/R2试剂比例为3/1-4/1，肌氨酸样本与总体试剂量的比例为1/25 1/20。2.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述缓冲液包括Tris-HCL缓冲液、磷酸盐缓冲液或N-三羟基代甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，缓冲液PH值为7. (T9. O。3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述色原包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)或N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)或N-(2-羟基-3-磺丙基)_3’ 5- 二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)。4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，不同所述色原所采用的检测主波长不同...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖飞，刘明，王萌，王大光，许宏涛，邹丽辉，黄薇，
申请(专利权)人：卫生部北京医院，
类型：发明
国别省市：
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