树突状细胞子集CD103制造技术

本发明专利技术公开了树突状细胞子集CD103

Dendritic cell subset CD103

The invention discloses the subset of dendritic cells, CD103

【技术实现步骤摘要】
树突状细胞子集CD103+DC的体外培养方法及鉴定方法
本专利技术涉及细胞体外培养
，具体涉及树突状细胞子集CD103+DC的体外培养方法及鉴定方法。
技术介绍
树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是目前所知功能最强的专职抗原提呈细胞，能高效地摄取、加工和提呈抗原。未成熟的DC具有较强的迁移能力，成熟的DC表面会形成树突样结构，它可刺激幼稚T细胞和B细胞的分化，在调节天然免疫与获得性免疫维持机体稳态方面起着重要作用。自加拿大学者Steinman于1973年发现树突状细胞以来，它的生物学活性作用一直是人们研究的热点，目前实验研究主要靠自主分离培养为主，成熟稳定的分离培养方法显得尤其重要。根据DCs表面分子表达情况可将其分为不同的子集，CD103+DC是其中一个重要的子集，是能够表达整合素分子αEβ7的α链CD103分子的树突状细胞。肠道CD103+DC不仅可以诱导调节性T细胞(Tregulatorycells,treg)的产生，而且可以指导T细胞表面归巢分子CCR9和α4β7的表达。研究发现，当机体处于稳态时，小肠固有层(Laminapropia,LP)中的CD103+DC主要诱导调节性T细胞的形成和T细胞的归巢，从而启动免疫耐受。在视黄酸(RA)和TGF-β的作用下，LP中CD103+DC可诱导肠粘膜调节性T细胞CD4+Foxp3+Treg的产生；在肠系膜淋巴结(Mesentericlymphnodes，MLN)中，迁移性CD103+DC不仅可影响肠道T细胞和B细胞表面归巢分子的表达，而且能够诱导Foxp3+Treg的产生，Annacker等研究表明当存在CD103+DC时，Treg细胞可抑制T细胞介导的结肠炎。当机体处于病理状态时，肠道上皮发生炎性浸润时，CD103+DC能够将突触伸入肠腔捕获抗原，携带抗原的CD103+DC在CCR7介导下进入肠系膜淋巴结，在TLR配体的刺激下CD103+DC能分泌IL-6，进而诱导TH17的分化，参与固有免疫反应和某些炎性反应。Schlitzer等人研究发现，选择性CD103+DC缺陷小鼠肠道MLN缺乏内源性TH17细胞。刘颂利用STING基因敲除小鼠证明，CD103+cDC内的STING能够识别细菌释放的c-di-GMP，进而介导肠粘膜TH17应答，抑制Treg分化。由此可见，CD103+DC在维持肠黏膜免疫与免疫耐受平衡中起着重要作用，建立一种CD103+DC稳定的体外培养方法，对研究CD103+DC起源、生物学特征、治疗应用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了树突状细胞子集CD103+DC的体外培养方法及鉴定方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：树突状细胞子集CD103+DC的体外培养方法，所述树突状细胞子集CD103+DC为小鼠骨髓源CD103+DC，体外培养方法包括以下步骤：1)配制完全培养基：完全培养基是由含有FLT3L、GM-CSF、FBS和双抗的RPMI-1640培养基配制而成，其中FLT3L的含量为200ng/mL，GM-CSF的含量为10ng/mL，FBS的含量按照质量百分比计为10％，双抗的含量按照质量百分比计为1％；2)小鼠骨髓源细胞的培养：取6-8周龄C57BL/6小鼠，脱颈处死，置于75％酒精中浸泡30min；用DPBS冲洗小鼠胫骨、腓骨腔以获得骨髓源细胞，获得的骨髓源细胞以离心力300g离心5min，弃上清；加入3倍体积的红细胞裂解液作用2min，以离心力300g离心5min，弃上清；加入DPBS悬浮细胞，用细胞筛过滤，滤液以离心力300g离心5min，弃上清；加入完全培养基悬浮细胞，使细胞浓度最终为1.5×107个/mL，移至6孔板中培养；培养至第5d，每孔加入1/2体积(移至6孔板中的细胞培养液的1/2)的完全培养基，继续培养；于第9d收集细胞，以离心力300g离心5min；加入完全培养基重悬，继续培养至第15d，收获细胞。本专利技术的第二个目的是提供了上述树突状细胞子集CD103+DC的体外培养方法培养得到的小鼠骨髓源树突状细胞子集CD103+DC。本专利技术的第三个目的是提供了上述小鼠骨髓源树突状细胞子集CD103+DC的鉴定方法，是在骨髓源细胞培养至第15d时，分别进行喷晶扫描电镜观察和荧光显微镜观察；在骨髓源细胞培养至第16d时，进行流式细胞术鉴定。进一步的，上述的鉴定方法，所述喷晶扫描电镜观察过程为：将培养至第15d的骨髓源细胞，加100ng/mLLPS处理24h；收集细胞至15mL离心管，以离心力300g离心5min；将细胞用完全培养基重悬，转入放置多聚赖氨酸包被无菌盖玻片的48孔细胞培养板中，培养24h后见部分细胞贴壁，弃去细胞悬液；用DPBS清洗3次，每次5min；2.5％的戊二醛4℃固定1h；弃去戊二醛，DPBS清洗3次；依次用30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％的乙醇逐级脱水，自然干燥；取出盖玻片，喷晶扫描电镜观察。进一步的，上述的鉴定方法，所述荧光显微镜观察过程为：将培养至第15d的骨髓源细胞，加100ng/mLLPS处理24h；收集细胞至15mL离心管，以离心力300g离心5min；将细胞用完全培养基重悬，转入放置多聚赖氨酸包被无菌盖玻片的6孔细胞培养板中，培养24h后见部分细胞贴壁，弃去细胞悬液；用DPBS清洗3次，每次5min；4％多聚甲醛室温下固定20min，DPBS清洗3次；0.2％Triton-100通透15min，DPBS清洗3次；5％BSA于4℃下包被30min，DPBS清洗3次；按体积比1：100比例加入Anti-MouseCD103一抗(一抗是前者，即为一抗的工作浓度)，37℃温箱孵育2h，DPBS清洗3次；按1：100比例加入AntibodyToRabbitIgG(H+L)二抗(二抗是前者，即为二抗的工作浓度)，37℃温箱避光孵育1h，DPBS清洗3次；加入10μLDAPI，室温下孵育10min，DPBS清洗3次；取出盖玻片，用荧光淬灭剂封片；荧光显微镜观察。进一步的，上述的鉴定方法，流式细胞术鉴定过程为：收集培养至16d的骨髓源细胞至15mL离心管，以离心力300g离心5min，弃上清，DPBS清洗2次；用DPBS将细胞浓度调整至1×106个/mL；分别取1mL细胞悬液转入2个1.5mL的EP管中，其中1管加入5μL的Anti-MouseCD103-PE，另1管加入同型对照仓鼠IgG-PE，37℃避光孵育30min；以离心力300g离心5min；弃上清，DPBS清洗两次；分别加入500μLDPBS重悬细胞，过膜并转移至专用检测管，流式细胞仪检测。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的树突状细胞子集CD103+DC的体外培养方法及鉴定方法，CD103+DC在维持肠黏膜免疫与免疫耐受平衡中起着重要作用，建立一种CD103+DC稳定的体外培养方法，对研究CD103+DC起源、生物学特征、治疗应用具有重要意义。本专利技术参考相关文献，以C57BL/6雌性小鼠的胫骨和腓骨骨髓为分离源，获得了骨髓细胞；以含有10％FBS、10ng/mLGM-CSF和200ng/mLFLT3L的RPMI-1640完全培本文档来自技高网...

【技术保护点】
树突状细胞子集CD103

【技术特征摘要】
1.树突状细胞子集CD103+DC的体外培养方法，其特征在于，所述树突状细胞子集CD103+DC为小鼠骨髓源CD103+DC，体外培养方法包括以下步骤：1)配制完全培养基：完全培养基是由含有FLT3L、GM-CSF、FBS和双抗的RPMI-1640培养基配制而成，其中FLT3L的含量为200ng/mL，GM-CSF的含量为10ng/mL，FBS的含量按照质量百分比计为10％，双抗的含量按照质量百分比计为1％；2)小鼠骨髓源细胞的培养：取6-8周龄C57BL/6小鼠，脱颈处死，置于75％酒精中浸泡30min；用DPBS冲洗小鼠胫骨、腓骨腔以获得骨髓源细胞，获得的骨髓源细胞以离心力300g离心5min，弃上清；加入3倍体积的红细胞裂解液作用2min，以离心力300g离心5min，弃上清；加入DPBS悬浮细胞，用细胞筛过滤，滤液以离心力300g离心5min，弃上清；加入一定体积的完全培养基悬浮细胞，使细胞浓度最终为1.5×107个/mL，并移至6孔板中培养；培养至第5d，每孔加入1/2体积的完全培养基，继续培养；于第9d收集细胞，以离心力300g离心5min；加入完全培养基重悬，继续培养至第15d，收获细胞。2.根据权利要求1所述的树突状细胞子集CD103+DC的体外培养方法培养得到的小鼠骨髓源树突状细胞子集CD103+DC。3.根据权利要求2所述的小鼠骨髓源树突状细胞子集CD103+DC的鉴定方法，其特征在于，是在骨髓源细胞培养至第15d时，分别进行喷晶扫描电镜观察和荧光显微镜观察；在骨髓源细胞培养至第16d时，进行流式细胞术鉴定。4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述喷晶扫描电镜观察过程为：将培养至第15d的骨髓源细胞，加100ng/mLLPS处理24h；收集细胞至15mL离心管，以离心力300g离心5min；将细胞用完全培养基重悬，转入放置多聚赖氨酸包被无菌盖玻片的48孔细胞培养板中，培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建喜，张景艳，张凯，侯艳华，王磊，王学智，张康，王旭荣，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62