【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体为一种多重荧光定量pcr检测奶牛乳房炎病原菌的引物探针组和检测方法。
技术介绍
1、奶牛乳房炎(bovine mastitis)是由于物理损伤、化学刺激或多种病原微生物感染引起的乳腺组织炎症，可导致奶牛产奶量下降、繁殖性能降低、乳制品品质降低等问题，已成为制约奶牛养殖业和乳制品业的主要疾病之一。
2、动物自身因素、饲养管理和微生物感染等多种因素均可以导致奶牛乳房炎。其中微生物感染是导致奶牛乳房炎的主要原因，已有超过150多种细菌被鉴定为奶牛乳房炎的病原菌，主要包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌等。目前治疗奶牛乳房炎最常见的方法是使用抗生素，但在未确定病原菌的情况下，贸然使用抗生素对奶牛乳房炎进行治疗，不仅治疗效果不好，而且会造成病原菌耐药性提高和药物残留，因此针对奶牛乳房炎的早期诊断，确定细菌种类对于正确、快速选择治疗用抗生素具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种多重荧光定量pcr检测奶牛乳房炎病原菌的引物探针组和检测方法，其能够通过两管反应体系一次性鉴定出6种常见的奶牛乳房炎病原菌。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种多重荧光定量pcr检测奶牛乳房炎病原菌的引物探针组，包括检测金黄色葡萄球菌的引物对一和探针一、检测无乳链球菌的引物对二和探针二、检测停乳链球菌的引物对三和探针三、检测大肠杆菌的引物对四和探针四、检测肺炎克雷伯菌的引物对五和探针五、检测
4、其中，所述引物对一包括正向引物一(nuc-f)和反向引物一(nuc-r)，所述正向引物一(nuc-f)、反向引物一(nuc-r)、探针一(nuc-p)序列如下：
5、正向引物一(nuc-f)：5’-cagtgcaacttcaactaa-3’，
6、反向引物一(nuc-r)：5’-gtctgaatgtcattgtttg-3’，
7、探针一(nuc-p)：5’-fam-ttaaccgtatcaccatcaatcgctt-bhq1-3’，
8、所述引物对二包括正向引物二(eftu-f)和反向引物二(eftu-r)，所述正向引物二(eftu-f)、反向引物二(eftu-r)、探针二(eftu-p)序列如下：
9、正向引物二(eftu-f)：5’-actggtgttgaaatgttc-3’，
10、反向引物二(eftu-r)：5’-cacgttcgatttcatcac-3’，
11、探针二(eftu-p)：5’-vic-aacaccacgaagaagaacaccaac-bhq1-3’，
12、所述引物对三包括正向引物三(tpch-f)和反向引物三(tpch-f)，所述正向引物三(tpch-f)、反向引物三(tpch-f)、探针三(tpch-p)序列如下：
13、正向引物三(tpch-f)：5’-tgctcttcataacaataataaac-3’，
14、反向引物三(tpch-f)：5’-ctggaggcgtaatattaac-3’，
15、探针三(tpch-p)：5’-cy5-tcgttctaaccagtgaccgca-bhq2-3’，
16、所述引物对四包括正向引物四(phoa-f)和反向引物四(phoa-r)，所述正向引物四(phoa-f)、反向引物四(phoa-r)、探针四(phoa-p)序列如下：
17、正向引物四(phoa-f)：5’-ggctttcatggtgtagaa-3’，
18、反向引物四(phoa-r)：5’-cagtgatggtgatgagtta-3’，
19、探针四(phoa-p)：5’-fam-ccgaagaggattcacaagaacatacc-bhq1-3’，
20、所述引物对五包括正向引物五(rcsa-f)和反向引物五(rcsa-r)，所述正向引物五(rcsa-f)、反向引物五(rcsa-r)、探针五(rcsa-p)序列如下：
21、正向引物五(rcsa-f)：5’-gtgcatgatgatgaaagtaa-3’，
22、反向引物五(rcsa-r)：5’-cggtcaaaatggatgttc-3’，
23、探针五(rcsa-p)：5’-vic-cattattcgccagatcattacgcaa-bhq1-3’，
24、所述引物对六包括正向引物六(urer-f)和反向引物(urer-r)，所述正向引物六(urer-f)、反向引物六(urer-r)、探针六(urer-p)序列如下：
25、正向引物六(urer-f)：5’-cctgaggtggttaaaacta-3’，
26、反向引物六(urer-r)：5’-gaccccttcgtgataaac-3’，
27、探针六(urer-p)：5’-cy5-cgttacttcagcaatgtctaccgc-bhq2-3’。
28、优选的，在探针的5’端连接有不同的荧光基团，3’端连接有相对应的淬灭基团。
29、优选的，所述荧光基团分别为fam、vic或cy5，所述淬灭基团为bhq1或bhq2。
30、本专利技术还提供一种试剂盒，包括上述所述的多重pcr引物和探针组合，上述试剂盒在鉴定黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等对奶牛乳房炎6种病原菌中的用途。
31、本专利技术还提供一种多重荧光定量pcr芯片，包括上述所述的多重pcr引物和探针组合。上述多重荧光定量pcr芯片在鉴定黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等对奶牛乳房炎6种病原菌中的用途。
32、本专利技术还提供一种多重荧光定量pcr检测奶牛乳房炎病原菌的检测方法，包括以下步骤：
33、(1)以待测样本的基因组dna为模版，使用上述任意一项的多重pcr引物和探针组合或上述试剂盒进行pcr扩增；
34、(2)根据扩增曲线和ct值，判断待测样本中是否有黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等6种病原菌。
35、优选的，在步骤(1)中，荧光定量pcr的扩增体系1为：premix ex taq(probe qpcr)12.5μl，模板dna 2μl，nuc-f/r、eftu-f/r和tpch-f/r各1.125μl，nuc-p和e本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多重荧光定量PCR检测奶牛乳房炎病原菌的引物探针组，其特征在于：包括检测金黄色葡萄球菌的引物对一和探针一、检测无乳链球菌的引物对二和探针二、检测停乳链球菌的引物对三和探针三、检测大肠杆菌的引物对四和探针四、检测肺炎克雷伯菌的引物对五和探针五、检测奇异变形杆菌的引物对六和探针六；所述金黄色葡萄球菌序列如pMD-19T-nuc所示，所述无乳链球菌序列如pMD-19T-eftu所示，所述停乳链球菌序列如pMD-19T-tpch所示，所述大肠杆菌序列如pMD-19T-phoa所示，所述肺炎克雷伯菌序列如pMD-19T-rcsa所示，所述奇异变形杆菌序列如pMD-19T-urer所示；
2.根据权利要求1所述的一种多重荧光定量PCR检测奶牛乳房炎病原菌的引物探针组，其特征在于：在探针的5’端连接有不同的荧光基团，3’端连接有相对应的淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的一种多重荧光定量PCR检测奶牛乳房炎病原菌的引物探针组，其特征在于：所述荧光基团分别为FAM、VIC或CY5，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
4.一种试剂盒，其特征在于：包括权利
5.一种多重荧光定量PCR芯片，其特征在于：包括权利要求1～3任一一项所述的引物探针组。
6.权利要求1～3任一一项所述的引物探针组、权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5所述的多重荧光定量PCR芯片在鉴定对奶牛乳房炎6种病原菌中的用途。
7.一种多重荧光定量PCR检测奶牛乳房炎病原菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的一种多重荧光定量PCR检测奶牛乳房炎病原菌的检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，荧光定量PCR的扩增体系1为：Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，模板DNA 2μL，Nuc-F/R、Eftu-F/R和Tpch-F/R各1.125μL，Nuc-P和Eftu-P各1.25μL，Tpch-P 1.125μL，加水补齐至25μL；荧光定量PCR的扩增体系2为：Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，模板DNA共2μL，Phoa-F/R、Rcsa-F/R和Urer-F/R各1.125μL，Phoa-P、Rcsa-P各1.125μL，Urer-P 1.25μL，加水补齐至25μL。
9.根据权利要求7所述的一种多重荧光定量PCR检测奶牛乳房炎病原菌的检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述荧光定量PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s；55.5℃退火30s；共40个循环，并收集荧光信号值。
10.根据权利要求7所述的一种多重荧光定量PCR检测奶牛乳房炎病原菌的检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，若有扩增曲线，且满足Ct值≤35，说明待测样本中有多重荧光定量PCR引物和探针荧光基团所对应的病原菌；若无扩增曲线，说明待测样本中无金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、以及奇异变形杆菌。
...【技术特征摘要】
1.一种多重荧光定量pcr检测奶牛乳房炎病原菌的引物探针组，其特征在于：包括检测金黄色葡萄球菌的引物对一和探针一、检测无乳链球菌的引物对二和探针二、检测停乳链球菌的引物对三和探针三、检测大肠杆菌的引物对四和探针四、检测肺炎克雷伯菌的引物对五和探针五、检测奇异变形杆菌的引物对六和探针六；所述金黄色葡萄球菌序列如pmd-19t-nuc所示，所述无乳链球菌序列如pmd-19t-eftu所示，所述停乳链球菌序列如pmd-19t-tpch所示，所述大肠杆菌序列如pmd-19t-phoa所示，所述肺炎克雷伯菌序列如pmd-19t-rcsa所示，所述奇异变形杆菌序列如pmd-19t-urer所示；
2.根据权利要求1所述的一种多重荧光定量pcr检测奶牛乳房炎病原菌的引物探针组，其特征在于：在探针的5’端连接有不同的荧光基团，3’端连接有相对应的淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的一种多重荧光定量pcr检测奶牛乳房炎病原菌的引物探针组，其特征在于：所述荧光基团分别为fam、vic或cy5，所述淬灭基团为bhq1或bhq2。
4.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1～3任一一项所述的引物探针组。
5.一种多重荧光定量pcr芯片，其特征在于：包括权利要求1～3任一一项所述的引物探针组。
6.权利要求1～3任一一项所述的引物探针组、权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5所述的多重荧光定量pcr芯片在鉴定对奶牛乳房炎6种病原菌中的用途。
7.一种多重...
【专利技术属性】
技术研发人员：许笑，李剑勇，朱安基，李世宏，杨亚军，刘希望，秦哲，白莉霞，葛闻博，李准，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：
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