一种单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法及其应用技术

一种单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法及其在核酸检测中的应用。反应液含内套引物和外套引物，内套引物与目标基因顺序有错配或在５’端带一段非基因专一顺序。内套引物与原始模板的最高允许退火温度低于第一轮反应的退火温度，而内套引物与匹配模板的解链温度高于外套引物的最高允许退火温度。控制第一轮ＰＣＲ循环的退火温度使外套引物能退火扩增但内套引物不能退火扩增。提高第二轮ＰＣＲ循环的退火温度使外套停止退火扩增而内套引物能退火扩增。在第一和第二轮之间有二至若干循环退火温度低于二者的过渡阶段，使内套引物能与原始模板退火扩增形成匹配模板启动第二轮反应。整个ＰＣＲ反应过程中不开管盖反应管也不移离基因扩增仪。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学技术，特别是涉及嵌套式聚合酶链式反应的方法及其应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种高效体外扩增特定DNA的方法，在此基础上发展起来的嵌套式PCR(巢式PCR，Nested-PCR)的扩增专一性和灵敏性均显著提高。但传统的嵌套式PCR需要中途开启反应管盖分二轮进行既麻烦又显著增加了滞后污染的机会。九十年代建立了一种基于控制低外套引物浓度和高外套引物解链温度的单管嵌套式方法，(Gookin等Journal-Clinical-Microbiology，2002，40，4126，Forsman等Journal-Viological-Methods，2003，1111-11)这种方法需要通过试验来摸索确定合适的外套引物浓度。近年来出现将内套引物置于毛细管(ES，P9801642，July，31，1998和Nucleic-Acid-Research(1999)27(6)1564)，置于反应管盖内壁上(Walsh等Journal-Medical-Virology，2001，63259-63，Ratcliff等Journal-clinical-Microbiol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以基因组ＤＮＡ或ｃＤＮＡ为模板的单管原位嵌套式聚合酶链式反应方法，反应液含至少一对外套引物和至少一个内套引物，内套引物顺序与原始目标模板顺序有错配或在５’端有一段非基因专一顺序。ＰＣＲ反应依次包括如下步骤：（１）ＤＮＡ模板变性解链；（２）引物与模板退火；（３）在ＤＮＡ聚合酶催化下延伸合成互补ＤＮＡ链；（４）按步骤（１）－（３）循环进行扩增反应；按退火溫度擴增分为二輪反應，其特征在于二輪反應之間不打開反應管蓋並保持原位。第二轮内套反应的退火温度高于第一轮外套反应的退火温度，二轮反应之间的过渡循环的退火温度比二轮反应都低。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐定邦，谢文凯，府雷宇，
申请(专利权)人：徐定邦，徐文慧，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]