具有脑定位活性的多肽及其用途制造技术

本发明专利技术合成了编码包含随机氨基酸序列的多肽的ＤＮＡ，并将其整合到噬菌体文库中。所生产的噬菌体文库被用于筛选具有脑定位活性的多肽。结果，获得了多种具有脑定位活性的多肽。这些多肽包含共同序列，且本发明专利技术成功地鉴定了与脑定位活性相关的氨基酸基序序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有脑定位活性(brain-localizing activity)的多肽，包含这些多肽的分子，以及赋予脑定位活性的药剂。
技术介绍
由于血脑屏障的存在，通过口服施用或者注射在脑中获得药物等地有效浓度要比在其他器官中更加困难。虽然可以通过大剂量施用以确保得到有效的药物浓度，但是这将意味着将过量的药物灌注到外周血中，这将产生副作用例如肾脏或肝脏损伤。因此，变得有必要开发一种选择性地将药物转运到脑中的系统。在这方面正在进行大量的研究。这些研究和开发中的大多数都致力于通过利用脑血管内皮细胞的特性对药物本身进行化学修饰以增强脑定位——物质的脂溶性越高，其越容易穿过血脑屏障。这种方法最多将药物在脑中的定位提高数倍，总的来说在误差范围内。在外周器官中，物质渗透穿过血管内皮细胞的细胞间隙，与此相反，在脑中，脑血管内皮细胞的细胞间隙形成称为紧密连接的特殊结构，几乎不允许血液成分穿过。因此，将物质转运到脑必须在对该物质进行化学修饰使之可溶于脂肪且可以直接整合到细胞膜中后，通过渗透进行。更特别地，不同于外周器官，由于没有替代路径用于将物质转运到脑中，这种方法使物质可以直接渗透到细胞中。但是，由于这种机制异于惯常，其效率低数千至数万倍。因此，这种方法不能被认为是脑特异性药物转运。随着近来的科技进步，已经开发出靶向在脑血管内皮细胞上表达的膜表面蛋白的技术。特别地，利用被称为转运蛋白的蛋白质的功能将药物掺入到脑中是有效的。如上所述，由于几乎没有任何物质通过细胞间隙渗透到脑中，血液中的氨基酸和糖通过与血脑屏障上表达的转运蛋白结合而被特异性地转运到脑中。运铁蛋白受体是将称为运铁蛋白的蛋白质转运到脑中的转运蛋白分子。运铁蛋白给脑活动所必需的金属酶供应金属离子。据报导，使用特化抗体靶向运铁蛋白受体，会使药物在脑中的定位提高数十倍到约上百倍(参见非专利文献1)。但是，运铁蛋白受体不仅在脑血管内皮细胞中表达，也在肝脏和肾脏中以更大的量表达。因此，当使用这种系统时，随着被转运到脑中的药物的量的增加，该药物也被导入肝脏和肾脏中。因此，这种方法也不能被称为脑特异性脑转运。此外，虽然已经有关于利用多种转运蛋白分子和反转运蛋白(antiporter)分子如P-糖蛋白的系统的报导，这些系统都未被证明是有效的。此外，最近开发出利用特殊的功能肽的方法。这些肽被称作为PTD序列，并被鉴定为HIV tat基因产物转运到细胞核所必需的肽序列。这些肽不仅穿过核膜，而且穿过所有种类的细胞膜(参见非专利文献2)，因此当该肽被注射到血液中时能够被分布到遍及整个机体的器官中。PTD肽能够将物质转运到脑中，因为它们能够穿过脑血管内皮细胞的细胞膜。但是，尽管PTD序列介导的通过细胞膜的转移和通过细胞间隙的渗透在外周器官中都是有效的，但是通过细胞间隙的渗透在脑中不存在，使得脑中的物质渗透性比在其他器官中低得多。因此，这种技术也不是脑特异性的。与此同时，最近已经报导了调节血管内皮细胞的器官特异性的分子。基于器官的功能和特异性，机体中的各个器官具有不同的营养需求和对血液供应的各种因子的不同需求程度。逐渐变得清楚的是，分布在器官中的血管内皮细胞根据其所存在的部位具有略微不同的特性。此外，血管内皮细胞作为与血液中存在的炎症细胞和免疫细胞的直接接触点，控制这些细胞在炎症和病理条件下的入侵。然后，通过识别炎症过程中出现的炎症归巢受体(inflammatory homing receptors)以及组织特异性血管内皮细胞标记分子(称为细胞邮递区号，cellularzip codes)，侵入细胞在病灶处积聚。虽然它们的作用还不清楚，但是这些细胞标记正在引起人们的注意，这是由于这些分子的靶向至少使得可以将感兴趣的分子靶向器官的血管内皮细胞(非专利文献3)。但是，虽然这种方法能够将感兴趣的分子靶向各个器官的血管内皮细胞，但还是必须设计出用于将该分子导入器官的实质中的系统。非专利文献1Ningya Shi and William M.Pardridge，Noninvasivegene targeting to the brain.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97，Issue 13，7567-7572，June 20，2000.非专利文献2Steven R.Schwarze，Alan Ho，AdaminaVocero-Akbani，and Steven E.Dowdy，In Vivo Protein TransductionDelivery of a Biologically Active Protein into the Mouse.Science 1999September 3；2851569-1572.非专利文献3Renata Pasqualini，Erkki Ruoslahti，Organ targetingin vivo using phage display peptide libraries.Nature Vol.380，28，March1996.
技术实现思路
本专利技术是在上述情形下完成的。本专利技术的一个目的是发现与脑定位活性相关的因子(基序序列)。本专利技术的另一个目的是提供具有脑定位活性的多肽，包含这些多肽的分子，以及赋予脑定位活性的药剂。本申请专利技术人进行了专门研究来解决上述的问题。细胞渗透到组织中的机制包括细胞通过细胞间隙的路径(细胞旁路径，paracellularpathways)和细胞穿过细胞的路径(跨细胞路径，transcellularpathways)。后一种路径被认为在特定条件下出现。当研究进入脑而不破坏血脑屏障的特定类型的细胞(小胶质细胞)的现象时，本申请专利技术人发现这种细胞具有诱导跨细胞路径的分子(Sawada，M.，Imai，F.，Suzuki，H.，Hayakawa，M.，Kanno，T.，Nagatsu，T.FEBS Lett，43337-40，1998.Brain-specific gene expression by immortalizedmicroglial cell-mediated gene transfer in the mammalian brain)。本申请专利技术人想到这种分子的活性位点的肽片段可以被用以确保脑特异性靶向和物质的转运，这到目前为止是不可能的。诱导上述机制的配体分子被认为存在于小胶质细胞中。因此，本申请专利技术人通过从小胶质细胞分离mRNA，制备cDNA文库，将该文库插入到T7噬菌体中，并筛选表达脑定位活性的噬菌体，从而成功地分离并鉴定到了感兴趣的分子。此外，本申请专利技术人合成了编码包含随机氨基酸序列的多肽的DNA，将它们插入到噬菌体文库中，并筛选具有脑定位活性的多肽。结果，本申请专利技术人获得了多种具有脑定位活性的多肽，并且成功地发现了被认为与脑定位活性相关的氨基酸基序序列及其序列特征。此外，本申请专利技术人将包含上述基序序列的合成多肽施用给试验动物，证实了这些多肽确实具有转运到脑中的活性。本申请专利技术人还进行了专门研究来阐明本专利技术的多肽转运到脑中的机制，并说明了这些多肽通过移行机制(transmigration mechanism)(跨细胞路径)转运到脑组织中。更特别地，本专利技术的多肽作为赋予移行诱导活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有脑定位活性的多肽，其中该多肽的１０％或更多由碱性氨基酸残基（Ｋ或Ｒ）组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：泽田诚，
申请(专利权)人：普洛图斯科学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]