使用饱和染料的扩增子解链分析制造技术

一种ＰＣＲ反应混合物，其特征在于，所述混合物包括　　　　靶核酸　　　　ＰＣＲ试剂　　　　为扩增靶核酸设置的寡核苷酸引物，以及　　　　具有至少５０％的饱和百分比的双链ＤＮＡ结合染料。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在双链核酸结合染料存在的条件下进行核酸分析的方法。
技术介绍
分析DNA序列变异的方法可以大体分为两类1)对已知序列变异的基因分型和2)对未知变异的扫描。现有多种已知序列变异基因分型的方法，并可以采用使用荧光探针的单一步骤、同质的、闭管的方法(Lay MJ等，Clin.Chem 1997；432262-7)。相反，大部分针对未知变异的扫描技术要求PCR之后的凝胶电泳或柱分离。这些技术包括单链构象多态性(Orita O等，Proc Natl Acad Sci USA1989；862766-70)、异源双链分子迁移(Nataraj AJ等，Electrophoresis 1999；201177-85)、变性梯度凝胶电泳(Abrams ES等，Genomics 1990；7463-75)、温度梯度凝胶电泳(Wartell RM等，J ChromatogrA 1998；806169-85)、酶或化学切割法(Taylor GR等，Genet Anal 1999；14181-6)以及DNA测序。通过测序识别新的突变也要求PCR之后的多个步骤，也就是测序和凝胶电泳循环。变性高效液相色谱(Xiao W等，Hum Mutat 2001；17439-74)涉及将PCR产物注入层析柱。最近，用于突变扫描的同质荧光方法已有报道。SYBR Green I(MolecularProbes，Eugene，Oregon)是一种在实时PCR中经常用于监测产物形成(WittwerCT等，BioTechniques 1997；22130-8)和解链温度(Ririe KM等，Anal.Biochem1997；245154-60)的双链特异性DNA染料。通过使用SYBR Green I的解链曲线分析，已经在167bp以内的产物中检测到杂合子单一碱基改变的存在(LipskyRH等，Clin Chem 2001；47635-44)。然而，扩增后在解链分析之前，对PCR产物进行了纯化并添加了高浓度的SYBR Green I。所述方法中用以检测的SYBR Green I浓度抑制PCR反应(Wittwer CT等，BioTechniques 1997；22130-1，134-8)；因而，该染料在扩增后添加。希望能有一种能用于检测杂合子单个碱基改变的存在并能在PCR之前加入的染料。单核苷酸多态性(SNPs)是目前为止在人类和其他物种中间观察到的最常见的遗传变异。在这些多态性中，个体之间仅有单个碱基的改变。所述改变可能引起蛋白中一个氨基酸的改变、改变转录速度、影响mRNA剪接、或对细胞过程没有明显作用。有时在所述改变沉默(例如，在其编码的氨基酸没有改变的情况下)的情况下，SNP基因分型可能仍具有价值，如果所述改变与由另一个遗传改变引起的独特表现型相连(关联的)。现有多种SNP基因分型的方法。大部分采用PCR或其他扩增技术以扩增感兴趣的模板。可以使用包括凝胶电泳、质谱和荧光在内的同步或后续分析技术。由于其是同质的，并且不需要在扩增开始后添加试剂或为了分析而对反应物手工取样，荧光技术是具有吸引力的。示范性的同类技术使用寡核苷酸引物定位感兴趣的区域以及荧光标记或染料用于产生信号。通过使用对DNA变性温度稳定的热稳定酶，示例性的基于PCR的方法是完全闭管的，这样在加热开始以后，不需要附加步骤。对于SNPs基因分型可以采用几种闭管的、同质的荧光PCR方法。这些方法包括使用有两个相互作用的发光基团的FRET寡核苷酸探针(邻近杂交探针，TaqMan探针，Molecular Beacons，Scorpions)、仅有一个荧光基团的单一寡核苷酸探针(G-淬灭探针，Crockett，A.O.和C.T.Wittwer，Anal.Biochem.2001；29089-97以及SimpleProbes，Idaho Technology)、以及使用双链DNA染料而不是共价荧光标记的寡核苷酸探针的技术。由于不需要标记的寡核苷酸探针，可以降低设计时间和检测成本，所述染料技术是具有吸引力的。已经公开了两种使用双链DNA染料的SNP分型技术。存在双链DNA染料情况下的等位基因特异性扩增可被用于实时PCR基因分型(Germer S等，Genome Research 2000；10258-266)。在Germer的参考文献的方法中，在存在一条共有反向引物的情况下，两条3’-碱基存在差异的等位基因特异性引物差异扩增一条或另一条等位基因。虽然不需要荧光标记的寡核苷酸，基因分型要求3条引物以及针对每种基因型的两个反应池。此外，需要监测每个循环荧光信号的实时PCR仪。另一种基于染料的方法不需要实时监测，每种SNP基因型仅需要一个反应池，并使用解链分析(Germer S等，Genome Research 1999；972-79)。在这种方法中，如前面的Germer方法一样，也使用了需要3条引物的等位基因特异性扩增。此外，所述引物中的一条含GC-发夹尾部，以提高一个扩增子的解链温度，使得在一个反应池中通过解链温度进行区分成为可能。PCR扩增后检测荧光，而不需要实时获得。专利技术概述本专利技术的一个方面提供了一种仅需要常规PCR试剂、引物、以及在PCR前简单添加“饱和的”双链DNA结合染料的方法。为了本专利技术的目的，“饱和的”染料是指该染料以为不存在染料情况下由PCR通常产生的双链DNA量(例如约10纳克/微升)提供最大荧光信号的浓度存在时，不会明显抑制PCR反应。虽然所述染料通过其饱和浓度时与PCR的兼容性进行鉴别，需要理解的是所述染料能以低得多的浓度使用。扩增过程中或紧随扩增之后，所述染料可以与使用标记引物情况下类似的方式通过解链曲线分析用于区分异源双链分子和同源双链分子。异源双链分子和同源双链分子的鉴别可以用于包括突变扫描和SNP基因分型在内的多种分析。术语“扫描”是指将一个核酸片段与一个参照核酸片段比较以检测序列上任何差异的存在的过程。表示存在序列差异的阳性结果不一定反映序列变异的确切性质或其在核酸片段上的位置。术语“基因分型”包括检测和确定已知的核酸序列变异，这些变异包括但不限于SNPs、碱基缺失、碱基插入、序列重复、重排、倒置、碱基甲基化、短串联重复数；以及在两倍体基因组的情况下，基因组是否是序列变异的纯合子或杂合子，以及一条DNA链上两个或更多序列变异的顺式/反式位置关系(单体型分析)。本专利技术的另一个方面，鉴别了多种双链DNA结合染料。本专利技术的双链DNA结合染料能在扩增中或扩增后以对于DNA的充分饱和量存在，同时对PCR的抑制最小化。例如，在最大PCR相容浓度下，双链DNA结合染料具有至少为50％的饱和百分比。在其他实施方式中，所述饱和百分比至少为80％，更特殊的至少为90％。在还有其他实施方式中，所述饱和百分比至少99％。需要理解的是，所述饱和百分比是与饱和浓度(也就是在存在预先确定的双链DNA量的情况下提供可能的最高荧光强度的浓度)的相同染料的荧光相比的荧光百分比。举例来说，预先确定的双链DNA量是100纳克/10微升，这是典型的PCR末期到达平台期时产生的DNA量。需要进一步理解到染料制剂可能包含抑制扩增的杂质。这样的杂质应该在确定饱和百分比之前去除。也需要理解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：C·T·威特沃，V·E·杜乔勒，G·里德，L·周，
申请(专利权)人：犹他大学研究基金会，爱达荷州技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：