本发明专利技术提供的是一种牛奶中致泻性大肠杆菌ＰＣＲ快速检测试剂盒及其制备方法。试剂盒的组成包括：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ：５．０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ：１．０μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ↓［２］：３．０μｌ、终浓度各１、０．５、１ｕＭ引物Ｐ１（ｅａｅＡ、ｉｐａＨ、ＳＴ）各：１．０μｌ、终浓度各１、０．５、１ｕＭ引物Ｐ２（ｅａｅＡ、ｉｐａＨ、ＳＴ）各：１．０μｌ、ＤＮＡ模板：５．０μｌ、ｄｄＨ↓［２］Ｏ：２９．５μｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／Ｌｌ）：０．５μｌ、Ｔｏｔａｌ：５０．０μｌ。ＰＣＲ反应条件为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４０ｓ，５１．３℃退火４０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，进行３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。本发明专利技术具有检测速度快、检出率高、灵敏度高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种生物监测技术。
技术介绍
大肠埃希氏菌是流行性兼性厌氧菌，寄生在人类的结肠部位，是婴儿出生一小时内在胃肠道定居的典型微生物。其后，大肠埃希氏菌通常与其宿主保持共生关系。大肠埃希氏菌在正常情况下被局限在狭窄的肠道内不致病，但是当宿主过度疲劳或免疫力下降时，或当正常胃肠道壁被破坏时。以致正常“良性”大肠埃希氏菌株也可引起感染。致泻性大肠埃希氏菌是引起感染性腹泻的病原菌之一。目前，根据致泻性大肠埃希氏菌的毒力因子，致病机理及其遗传控制，国际上将其分为五类——肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)、肠集聚性大肠埃希氏菌(EAggEC)，其中ETEC菌株通过LT和ST致病基因的作用引起腹泻。这些菌株可只表达LT。或只表达ST，或二者都表达。本实验中的所采用标准菌株44247(ETEC，O6:K15:H16)被Jav Sarantuya等人报道只含ST。EPEC是在发展中国家已被同婴儿腹泻联系在一起的一种重要的致腹泻大肠杆菌分类，其致病性与LEE毒力岛上的eaeA毒力基因有关。EIEC的侵袭机制是研究最为清楚的，其侵袭性是因为具有侵袭性质粒引起的，在侵袭性质粒上含有ipaH毒素基冈。目前采用的检测食品中这几种致泻型大肠杆菌的分离培养法阳性率低。且费时费力，需几周时间才能报告结果。近年来发展起来的聚合酶链式反应(PCR)检测技术具有减少检验时间、方法简单的优点，为大肠杆菌的快速检测提供了有力手段，但目前尚无同时检测几种腹泻致病菌的方法。 专利
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分别以ST、eaeA、ipaH毒素基因为目的基因设计引物。应用多重PCR同时扩增主要致病性大肠杆菌EPEC、EIEC和ETEC的毒力基因，建立一种牛奶中致泻型大肠杆菌PCR快速检测试剂盒。 本专利技术的目的是这样实现的 多重PCR快速检测试剂盒的组成包括 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI33.0μl DNA模板5.0μl ddH2O29.5μl Taq DNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl Total50.0μl 本专利技术的检测试剂盒还可以包括这样一些特征 1、所述的引物的浓度为 2、所述的模板DNA，是将样品或(ETEC、EPEC和EIEC)标准菌株混合物分别接种于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化钠，pH7.5的液体培养基中。200rpm/min、37±1℃摇床培养2.5h，采取裂解法或者试剂盒方法提取提取的DNA。 3、PCR反应条件为 95℃ 5min； 94℃ 40S，51.3℃ 40S，72℃ 1min，循环30次，再72℃延伸1Omin。 本专利技术的检测试剂盒是采用这样的方法来制备的 1、细菌的增菌培养 将ETEC、EPEC和EIEC标准菌株分别接种于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化钠，pH7.5的液体培养基中，37℃过夜培养。 2、模板DNA的提取及定量 采取裂解法或者试剂盒方法提取提取DNA,应用紫外可见分光光度计检测DNA的吸光值，先用去离子水洗4次石英比色皿，将提取的原DNA用去离子水稀释60倍。将3000μl去离子水的比色杯放入仪器中读取零值作参照。将稀释60倍后的DNA液加入到石英比色皿中上机检测，根据公式核酸(μg/ml)＝62.9×A260-36×A280计算DNA浓度将过夜培养的菌液做10倍递增稀释，选择2-3个适宜稀释度。吸取该稀释度1ml稀释液于灭菌平皿内。每个稀释度做两个平皿，及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿10-15ml，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照，待琼脂凝固后，翻转平板。置36±1℃温箱内培养48±2h，按照中国人民共和国国家标准食品微生物学检测菌落总数测定(GB4789.2-94)进行菌落计数； 3、引物的设计与合成 引物序列、扩增片段长度 4、建立单个PCR反应体系 PCR反应在0.5ml Eppendorf管中进行，采用50μl反应体系，各反应成分为 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI3 3.0μl 引物P1 1.0μl 引物P2 1.0μl DNA模板 5.0μl ddH2O 33.5μl TaqDNA聚合酶(5U/Ll) 0.5μl Total 50.0μl 引物浓度为 5、本专利技术的多重PCR反应条件为 95℃预变性5min；94℃变性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。 使用时取0.5ml奶样加到4.5ml LB液体培养基中，200rpm/min、37±1℃摇床培养2.5h，取36μl LB培养液，加入到1.5ml离心管中，在加入4μl的10×TE和60μl的2×蛋白酶K，56℃金属浴90min，95℃水浴10min，10,000×g离心1min，取上清做模板，制成试样，-20℃保存备用。按照PCR快速检测试剂盒反应体系的组成，即10×PCRbuffer 5.0μl；10mMdNTP 1.0μl；25mM MgCl2 3.0μl；引物P1各1.0μl；引物P2各1.0μl；DNA模板5.0μl；TaqDNA聚合酶(5U/Ll)0.5μl，其余用超纯水加至反应总体积为50.0μl。进行PCR扩增，95℃预变性5min；94℃变性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。再进行结果判定将50×TAE电泳缓冲液20ml加双蒸水稀释至1000ml(1×TAE)待用，14ml 1×TAE缓冲液于三角瓶中，加入3.5g琼脂糖加热溶解，冷至50℃左右后加入溴化乙锭(0.5μg/ml)0.5μl，倒人准备好的电泳平板上，电泳槽中加入1×TAE缓冲液，取PCR终产物按5∶1的比例加入溴酚蓝点样110V电泳25min，取出然后置于300nm的紫外透射仪上观察，样品出现和阳性对照在同一水平位置上的红橙色荧光带即为阳性，否则为阴性。 本专利技术的原理为 致泻性E.coli通过本身的致病基因引起腹泻，如ETEC菌株通过LT和ST致病基因致病。这些菌株可只表达LT，或只表达ST，或二者都表达。EPEC的致病性与LEE毒力岛上的eaeA毒力基因有关。EIEC的侵袭机制是研究最为清楚的，其侵袭性是因为具有侵袭性质粒引起的，在侵袭性质粒上含有ipaH毒素基因。本专利技术分别以ST、eaeA、ipaH毒素基因为目的基因设计引物，进行PCR扩增，证明这三对基因对相应致病菌是特异性的，且敏感性很高。所以，应用多重PCR技术在一次反应中同时扩增主要致病性大肠杆菌EPEC、EIEC和ETEC的毒力基因，以建立一种快速检测牛奶中致泻性大肠杆菌的PCR扩增方法。 本专利技术对牛奶中常见的腹泻致病性大肠杆菌即致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素大肠杆菌(ET本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛奶中致泻性大肠杆菌ＰＣＲ快速检测试剂盒，其特征是：其组成包括：１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ５．０μｌ１０ｍＭｄＮＴＰ１．０μｌ２５ｍＭＭｇＣｌ↓［２］ ３．０μｌ＊＊＊ＤＮＡ模板 即ＬＢ培养菌液提取的ＤＮＡ５．０μｌｄｄＨ↓［２］Ｏ２９．５μｌＴａｑＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／Ｌｌ）０．５μｌＴｏｔａｌ５０．０μｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李继昌，霍贵成，张铁男，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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