食源性致病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤： １）ＤＮＡ提取：将培养后的菌株标本提取ＤＮＡ； ２）通用引物的设计及ＰＣＲ产物的测序：根据食源性致病菌的１６ＳｒＲＮＡ和２３Ｓ ｒＲＮＡ基因的保守区域设计３对通用引物，各引物结合位置如下所示： Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（蜡样芽孢杆菌），Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（单增李斯特菌），Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．（变形杆菌），Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ（霍乱弧菌），Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化脓性链球菌），Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（金黄色葡萄球菌）的上游引物（Ｂ１－Ｆ）序列位于１６Ｓ ＲＮＡ的３２０－３３９处，序列为５′－ＣＡＣＡＣＴＧＧ（Ａ／Ｇ）ＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧ－３′，下游引物（Ｂ１－Ｒ）位于１６Ｓ ＲＮＡ的５１５－５３２处，序列为５′－ＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧ（Ｇ／Ｔ）ＡＧＴＴＡＧ－３′； ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ（致病性大肠杆菌）及Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．（志贺菌）上游引物（Ｂ３－Ｆ）位置位于１６Ｓ ＲＮＡ的８５０－８６８处，序列为５′－ＴＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＧ ＴＡＧＡＧＣ－３′，下游引物（Ｂ３－Ｒ）位于１６Ｓ ＲＮＡ的１０３１－１０４９处，序列为５′－ＴＧＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＧＴＴ－３′； Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（副溶血弧菌）上游引物（Ｂ２－Ｆ）位于置位于１６Ｓ ＲＮＡ的９５０－９７２处，序列为５′－ＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧ－３′，下游引物（Ｂ２－Ｒ）位于１６Ｓ ＲＮＡ的１０８９－１１１０处，序列为５′－ＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＣＡ－３′．其中Ｂ１－Ｆ／Ｒ、Ｂ２－Ｆ／Ｒ和Ｂ３－Ｆ／Ｒ扩增片段长度分别为２１３ｂｐ、１６１ｂｐ和２００ｂｐ； 为了确保探针结合区序列的保守性，对各类代表性菌株的ＰＣＲ产物进行测序，通过ＤＮＡ测序获得相关序列； ３）荧光双链置换探针的设计：将通过ＤＮＡ测序获得的相关序列结合ＧｅｎＢａｎｋ中相关的序列，利用引物设计软件Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ（１．８）和Ｂｌａｓｔｎ确定３对通用引物扩增区内各目标菌的标签序列，即探针的特异序列，探针的特异序列如表１： 表１ ＊＊＊ 然后根据探针的特异序列设计荧光双链置换探针，荧光双链置换探针序列如表２： 表２ ＊＊＊ ４）多色探针编码体系设计：采用单色或双色编码的探针检测相应的目标菌，通过荧光标记的荧光信号组合，实现在单管中对９类常见食源性致病菌的区分和检测，荧光标记和具体的编码设计方案如表３； 表３ ＊＊＊ 其中蜡样芽孢杆菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、致病性大肠杆菌和志贺菌（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ ＆ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、单增李斯特菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及沙门菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）采用单色编码的探针进行检测，这几种菌株标记的特异荧光信号依次分别为ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ和ＣＹ５；副溶血弧菌（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、变形杆菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．）、霍乱弧菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、化脓性链球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）和金黄色葡萄球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）则采用双色编码的探针进行检测，这几种菌株标记的特异荧光信号依次分别为ＦＡＭ＋ＨＥＸ、ＦＡＭ＋ＲＯＸ、ＦＡＭ＋ＣＹ５、ＨＥＸ＋ＲＯＸ和ＲＯＸ＋ＣＹ５，根据实时ＰＣＲ反应中采集的荧光信号的组合类型或编码，即可直接判断所检测模板的种类； ５）变温杂交反应：为了模拟实时ＰＣＲ反应中的探针杂交过程，考察探针置换杂交的特异性，同时确定实时ＰＣＲ反应的最佳检测温度，合成与检测探针匹配的靶序列及部分干扰序列见表４；合成的杂交序列比荧光链在两端多出若干个碱基； 表４ ＊＊＊ 表中，［ａ］↑“＊－ｗ”表示该序列与特异的探针序列完全互补，而代号为“［＊］↑－ｍ（１／２／３）”的，为互补序列的干扰序列．．黑体带下划线的碱基为干扰序列中与互补序列不同的碱基； ６）单重实时ＰＣＲ体系的构建； ７）多重多色实时ＰＣＲ体系的构建：通过组合单重实时ＰＣＲ体系，构建多重多色实时ＰＣＲ体系，多重多色实时ＰＣＲ体系含３对通用引物和１４对荧光双链置换探针，能在一个ＰＣＲ管中对９类食源性致病菌中任意一类的区分和检测； ８）多重多色实时ＰＣＲ体系的验证：验证采用１２９个菌株样本，１２９个菌株样本包括９种标准菌株和从临床病人或食物中获得的样本，以验证所建立体系的特异性，所述９种标准菌株为Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（蜡样芽孢杆菌），Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（单增李斯特菌），Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．（变形杆菌），Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ（霍乱弧菌），Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化脓性链球菌），Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（金黄色葡萄球菌），ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ（致病性大肠杆菌），Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．（志贺菌）和Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（副溶血弧菌）。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细菌的分子鉴定，尤其是涉及一种利用探针编码检测食源性致病菌的方 法，它是通过单一反应对多个食源性致病菌进行鉴定的实时PCR方法。
技术介绍
传统的细菌鉴定主要依靠细菌培养、血清学、生物化学及细菌形态学等方法进行分类鉴 定( 、 Gracias KS and McKillip JL. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food . Can J Microbiol, 2004, 50(ll):883-890)。传统的方法虽然可 靠，但是往往需要几天甚至几周的时间才能获得结果；而且细菌的表型会受环境的影响，从 而给鉴定带来困难；此夕卜，当细菌处于"VBNC"状态时，传统方法就难以检测(、 Oliver JD. The viable but nonculturable state in bacteria . J Microbiol, 2005， 43 Spec No:93-100)。分子生 物学手段，尤其是PCR技术以其快速、灵敏、特异等优点在食源性致病菌中广泛应用(、 Malomy B， Tassios PT， Radstrom P, et al. Standardization of diagnostic PCR for the detection of foodbome pathogens . Int J Food Microbiol, 2003, 83(l):39-48; 、 de Boer E and Beumer RR. Methodology for detection and typing of foodbome microorganisms . Int J Food Microbiol, 1999, 50(1-2): 119-130 ; 、 Fung DYC. Rapid methods and automation in microbiology . Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2002， 1:3-22)，成为传统检测方法重要 的补充手段。在各种PCR手段中，实时PCR将扩增和检测合二为一，具有快速、特异、灵敏和可定量 等优点，在病原微生物检测领域有广泛的应用(、扈庆华，郑薇薇，石晓路，等.双重实 时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌.中华微生物学和免疫学杂志，2004, 24(12): 1004-1007; 、 Nogva HK, Rudi K， Naterstad K, et al. Application of 5'-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk . Appl Environ Microbiol, 2000, 66(10) :4266-4271; 、 Chen W， Martinez G and Mulchandani A. Molecular beacons: a real-time polymerase chain reaction assay for detecting Salmonella . Anal Biochem, 2000, 280(1):166-172; 、 Fukushima H, Tsunomori Y and Seki R. Duplex real-time SYBR green PCR assays for detection of 17 species of food- orwaterborne'pathogens in stools . J Clin Microbiol, 2003， 41(11):5134-5146; PalomaresC, Torres MJ， Torres A, et al. Rapid detection and identification of Staphylococcus aureus from blood culture specimens using real-time fluorescence PCR . Diagn Microbiol Infect Dis， 2003, 45(3):183-189)。但多数检测方法使用单个荧光探针，只能检测一种靶序列。开发多目标多任 务的实时PCR能进一步提高检测通量和效率，在这方面不断有研究者提出新的方法。利用不 同荧光标记的探针，可同时对多个靶序列进行检测，如Vet等人( Vet JA, Maj他ia AR, Marras SA, et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons . ProcNatlAcadSci, 1999, 96(11):6394-6399)利用四色实时PCR对HTLV1、 HTLV2、 HIV-1和 HIV-2四种致病性逆转录病毒进行同时检测。但由于受到可检测的荧光种类的限制，实时PCR 难以在一次反应中同时检测更多的靶序列。新上市的五色实时PCR仪能同时检测5种不同荧 光染料，若使用5种不同的荧光标记探针则至多只能检测5种靶序列。Lee等( Lee LQ Livak KJ, Mullah B, et al. Seven-color, homogeneous detection of six PCR products . Biotechniques， 1999， 27(2):342-349.)利用荧光光度计同步扫描7种荧光染料，也只能同时检 测6种靶序列。此外，利用PCR扩增产物的熔点差异，在实时PCR扩增结束后进行熔点曲 线分析，可实现多个靶序列的同时检测( Elenitoba-Johnson KS, BoWing SD, Wittwer CT, et al. Multiplex PCR by multicolor fluorimetry and fluorescence melting curve analysis . Nat Med， 2001, 7(2):249-253; Herrmann Dobrowolski SF and Wittwer CT. Rapid beta-globin genotyping by multiplexing probe melting temperature and color . Clin Chem， 2000, 46(3):425-428)。但由于PCR产物的熔点范围狭窄，熔点曲线分析方法很难容下5个以上产 物的同时分析，而且容易受到引物二聚体等非特异扩增的干扰，使结果难以判断。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有的食源性致病菌检测方法中存在的不足，提供一种在四色实 时PCR仪上可实现对15种模板的基因分型的。本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
食源性致病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：１）ＤＮＡ提取：将培养后的菌株标本提取ＤＮＡ；２）通用引物的设计及ＰＣＲ产物的测序：根据食源性致病菌的１６ＳｒＲＮＡ和２３ＳｒＲＮＡ基因的保守区域设计３对通用引物，各引物结合位置如下所示：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（蜡样芽孢杆菌），Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（单增李斯特菌），Ｐｒｏｔｅｕｓｓｐｐ．（变形杆菌），Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ（霍乱弧菌），Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（化脓性链球菌），Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（金黄色葡萄球菌）的上游引物（Ｂ１－Ｆ）序列位于１６ＳＲＮＡ的３２０－３３９处，序列为５′－ＣＡＣＡＣＴＧＧ（Ａ／Ｇ）ＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧ－３′，下游引物（Ｂ１－Ｒ）位于１６ＳＲＮＡ的５１５－５３２处，序列为５′－ＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧ（Ｇ／Ｔ）ＡＧＴＴＡＧ－３′；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥ．ｃｏｌｉ（致病性大肠杆菌）及Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｐｐ．（志贺菌）上游引物（Ｂ３－Ｆ）位置位于１６ＳＲＮＡ的８５０－８６８处，序列为５′－ＴＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣ－３′，下游引物（Ｂ３－Ｒ）位于１６ＳＲＮＡ的１０３１－１０４９处，序列为５′－ＴＧＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＧＴＴ－３′；Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（副溶血弧菌）上游引物（Ｂ２－Ｆ）位于置位于１６ＳＲＮＡ的９５０－９７２处，序列为５′－ＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧ－３′，下游引物（Ｂ２－Ｒ）位于１６ＳＲＮＡ的１０８９－１１１０处，序列为５′－ＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＣＡ－３′．其中Ｂ１－Ｆ／Ｒ、Ｂ２－Ｆ／Ｒ和Ｂ３－Ｆ／Ｒ扩增片段长度分别为２１３ｂｐ、１６１ｂｐ和２００ｂｐ；为了确保探针结合区序列的保守性，对各类代表性菌株的ＰＣＲ产物进行测序，通过ＤＮＡ测序获得相关序列；３）荧光双链置换探针的设计：将通过ＤＮＡ测序获得的相关序列结合ＧｅｎＢａｎｋ中相关的序列，利用引物设计软件ＣｌｕｓｔａｌＸ（１．８）和Ｂｌａｓｔｎ确定３对通用引物扩增区内各目标菌的标签序列，即探针的特异序列，探针的特异序列如表１：表１＊＊＊然后根据探针的特异序列设计荧光双链置换探针，荧光双链置换探针序列如表２：表２＊＊＊４）多色探针编码体系设计：采用单色或双色编码的探针检测相应的目标菌，通过荧光标记的荧光信号组合，实现在单管中对９类常见食源性致病菌的区分和检测，荧光标记和具体的编码设计方案如表３；表３＊＊＊其中蜡样芽孢杆菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、致病性大肠杆菌和志贺菌（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥ．ｃｏｌｉ＆Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｐｐ．）、单增李斯特菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及沙门菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐ．）采用单色编码的探针进行检测，这几种菌株标记的特异荧光信号依次分别为ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ和ＣＹ５；副溶血弧菌（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、变形杆菌（Ｐｒｏｔｅｕｓｓｐｐ．）、霍乱弧菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、化脓性链球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）和金黄色葡萄球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）则采用双色编码的探针进行检测，这几种菌株标记的特异荧光信号依次分别为ＦＡＭ＋ＨＥＸ、ＦＡＭ＋ＲＯＸ、ＦＡＭ＋ＣＹ５、ＨＥＸ＋ＲＯＸ和ＲＯＸ＋ＣＹ５，根据实时ＰＣＲ反应中采集的荧光信号的组合类型或编码，即可直接判断所检测模板的种类；５）变温杂交反应：为了模拟实时ＰＣＲ反应中的探针杂交过程，考察探针置换杂交的特异性，同时确定实时ＰＣＲ反应的最佳检测温度，合成与检测探针匹配的靶序列及部分干扰序列见表４；合成的杂交序列比荧光链在两端多出若干个碱基；表４＊＊＊表中，［ａ］↑“＊－ｗ”表示该序列与特异的探针序列完全互补，而代号为“［＊］↑－ｍ（１／２／３）”的，为互补序列的干扰序列．．黑体带下划线的碱基为干扰序列中与互补序列不同的碱基；６）单重实时ＰＣＲ体系的构建；７）多重多色实时ＰＣＲ体系的构建：通过组合单重实时ＰＣＲ体系，构建多重多色实时ＰＣＲ体系，多重多色实时ＰＣＲ体系含３对通用引物和１４对荧光双链置换探针，能在一个ＰＣＲ管中对９类食源性致病菌中任意一类的区分和检测；８）多重多色实时ＰＣＲ体系的验证：验证采用１２９个菌株样本，１２９个菌株样本包括９种标准菌株和从临床病人或食物中获得的样本，以验证所建立体系的特异性，所述９种标准菌株为Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（蜡样芽孢杆菌），Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（单增李斯特菌），Ｐｒｏｔｅｕｓｓｐｐ．（变形杆菌），Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ（霍乱弧菌），Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（化脓性链球菌），Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（金黄色葡萄球菌），ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥ．ｃｏｌｉ（致病性大肠杆菌），Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｐｐ．（志贺菌）和Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（副溶血弧菌...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：牛建军，李庆阁，黄建炜，张佳峰，郑琳琳，
申请(专利权)人：厦门市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：92
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