一种筛选乳酸生产率高的菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种辅助筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法。本发明专利技术方法包括如下步骤：１）培养待筛选样品，挑取产酸但不产气的菌株，获得产酸不产气菌株；２）培养所述产酸不产气菌株，挑取对数生长期内生长速率高于０．２ｈ↑［－１］的菌株，获得候选乳酸生产率高的乳酸菌。本发明专利技术筛选方法实现了乳酸生产率高菌株的快速、高通量筛选，解决了目前工业乳酸菌株筛选过程中费时、费力、筛选效率不高的缺点，为乳酸发酵提供了大量的供选择的菌种资源，为进一步优化改良提高乳酸产量和生产率、降低成本奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。技术背景随着石油资源的不断减少以及不可再生资源价格的节节攀升，开发利用环境友 好的生物基产品己成为转变经济增长方式、保障生态链良性循环、实现经济社会可 持续发展的战略需求。乳酸是一种重要的、多用途生物基平台化合物，它有两种旋 光异构体，其中L-乳酸可用作酸味剂、芳香剂、防腐剂、植物生长调节剂等，在食 品、制药、酿造、制革、纺织和农业中具有广泛用途。乳酸的两个功能集团可以进 行多种化学反应，包括聚合、酯化、还原和取代反应。利用这些反应，乳酸可被用 来生产多种在工业和消费品领域中具有重要用途的产品，包括高聚物(如聚乳酸)、 溶剂(如乳酸乙酯、乳酸丙酯、乳酸丁酯等)及含氧化学品(如丙二醇、环氧丙烷、 丙烯酸等)，其中最重要、最大宗的工业应用，是用于生产可降解聚合物-聚乳酸， 聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性及优良的机械性能和物理性能，因而被产业 界认为是新世纪最有发展前途的新型包装材料，将有望逐步替代聚乙烯、聚丙烯、 聚苯乙烯等材料。作为一种能够由可再生碳水化合物转化而来的重要平台化合物， 近年来乳酸受到了全世界研究人员和生产企业的极大关注。2005年全球乳酸产量己 经达到12万吨，其中20-30%应用在新的工业领域中。随着乳酸新的、大宗的应用 不断开发，全球乳酸的市场需求将持续增长。根据预测，如果10-20年后全球范围内生物基塑料能够替代石油基塑料消费量 的10-20%,聚乳酸的年需求量将达到1150-2300万吨。目前全球乳酸产量只有这一 预测值的1%，其核心问题是L-乳酸生产成本和市场价格仍然偏高。解决这一问题 的关键之一是提高菌株的乳酸生产率，目前己知的大多数菌种的发酵生产率较低， 导致发酵周期长，生产成本偏高，从而导致聚乳酸市场开拓受阻。在现有技术基础 上对已有菌株进行简单优化或改良对进一步提高乳酸生产率，降低生产成本贡献甚 微，因此需要从天然生境中筛选高乳酸生产率的优良菌株，并通过正向、反向和进 化代谢工程等技术手段进一步提高并改进菌株的乳酸生产效率、对环境的胁迫能 力，从而使菌株能够高效、大量生产L-乳酸，突破聚合级L-乳酸发酵生产的技术瓶颈，为以可再生生物质为原料大规模、低成本地生产高纯度L-乳酸奠定技术基础。菌种是乳酸发酵的主体和基本要素，能够产生乳酸的微生物有很多，但就工业 意义上来说，乳酸杆菌具有最大的工业应用价值。乳酸杆菌包括两种发酵类型，同 型发酵和异型发酵。同型发酵菌株在发酵过程中只产生乳酸作为发酵产物，因此是 理想的工业乳酸发酵菌株。目前在工业上获得应用的同型发酵菌株主要包括鼠李 糖乳杆菌(Za"oZ^ci72〃51 r/ a/ masiAs)、干酪乳杆菌(La"o力3ci77w5 case力禾口德 氏乳杆菌03"oZ^cj7^as oW力rwech'力等。自然界中蕴藏着大量有潜力的乳酸产 生菌，从环境中筛选天然优良菌株是提高乳酸发酵性能、降低乳酸发酵成本的第一 步。美国阿贡国家实验室Tsai等根据选择合适碳源、乳酸发酵类型、对产物耐受 能力、产物立体专一性、菌体细胞分离的难易程度、高温耐受等筛选标准，经2轮 8套筛选，最终筛选获得耐高温、耐自身发酵产物的优良菌种。Carlson和Peters 的专利公开了耐乳酸同型发酵的筛选方案，他们从玉米浸渍浆水中分离了近百株同 型乳酸发酵菌种，得到一株在葡萄糖和不同量玉米浆水的培养基中47。C发酵6 h 产乳酸接近100 g/L的耐酸菌种。上述方法虽然能有效筛选到目的菌株，但是其不 足是不能高通量筛选，存在极大的局限性。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种辅助筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法。 本专利技术所提供的辅助筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法，包括如下步骤1) 培养待筛选样品，挑取产酸但不产气的菌株，获得产酸不产气菌株；2) 培养所述产酸不产气菌株，挑取对数生长期内生长速率高于0.2h-'的菌株， 获得候选乳酸生产率高的乳酸菌；所述对数生长期内生长速率是按照如下公式计算的V二 (0D,- 0D。) / At; 0D。为对数生长期内检测起始时间点对应的0D6Q。值；0Di为对数生长期内检测终止时间点对应的0D6。。值；A t为终止时间点至起始时间点之间的时间段。 V为对数生长期内生长速率。所述挑取对数生长期内生长速率高于0.2 h—'的菌株的方法包括如下步骤将所述产酸不产气菌株接种于装有培养基的孔板中，再将所述孔板置于酶标仪中进行 培养，在培养期的不同时间点直接读取培养液的0D6。。值，按照所述公式计算得到所 述菌的对数生长期内生长速率，筛选获得对数生长期内生长速率高于0.2 h—'的菌株。此步骤是利用酶标仪进行培养和读数，方便了生长率的获得，省时省力。所述培养中所用到的培养基为MRS培养基。所述乳酸菌为同型发酵乳酸菌。本专利技术的另一个目的是提供一种筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法。 本专利技术所提供的筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法，是用上述任一所述方法获 得候选菌后，再对候选菌的乳酸生产率进行鉴定，如果所述候选菌的乳酸生产率大等于3. 9±0. 1 g/L h，则所述候选菌为乳酸生产率高的乳酸菌。同型发酵菌株在发酵过程中只产生乳酸，而且这一途径是唯一的产能途径，因 此同型发酵菌株的产乳酸过程与菌株的生长和繁殖是直接相关的，因此通过筛选生 长快速的同型发酵菌株可以获得高乳酸生产率的菌株。本专利技术基于这一原理，建立 了通过酶标仪从天然环境中高通量筛选高生产率乳酸菌的方法。本专利技术筛选方法将来自自然环境中的发酵样品用生理盐水连续10倍稀释后， 涂布在含溴甲酚绿的MRS平板上培养，获得产酸圈较大的产酸菌；通过在96深孔 板倒置的杜氏小管中观察是否产气，筛选不产气的细菌即为同型发酵菌株；然后通 过酶标仪测定菌株生长曲线，选取生长速率高的菌株即为乳酸生产率高的菌株。在 本专利技术筛选方法的基础上，可以通过生理生化试验鉴定菌株的种类，建立高生产率 乳酸菌株库，为乳酸发酵的工业化提供更加充足的菌种资源；可以通过进一步的耐 高盐、耐高糖等发酵性能的检测，筛选出满足工业化生产的潜在菌株；还可以对具 有乳酸高生产率的菌株做进一步的遗传改造，获得更优良工业菌株。本专利技术筛选方法实现了乳酸生产率高菌株的快速、高通量筛选，解决了目前工 业乳酸菌株筛选过程中费时、费力、筛选效率不高的缺点，为乳酸发酵提供了大量 的供选择的菌种资源，为进一步优化改良提高乳酸产量和生产率、降低成本奠定了基石出。 .附图说明图1为乳酸生产率高菌株的筛选流程图。图2为51株同型发酵乳酸菌菌株的生长速率与乳酸生产率的关系图。 图3为L-乳酸标准品的色谱图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中所使用的培养基的组成如下筛选培养基和种子培养基均为MRS培养基，其组成为20g/L葡萄糖、10g/L 蛋白胨、10 g/L牛肉膏、5 g/L酵母提取物、2 g/L K2HP04、 2 g/L柠檬酸铵、2 g/L 醋酸钠、0. 58 g/L MgS04 7H20、 0. 25 g/L MnS04 4H20、 1 ml/L Tween-80，其余 为水，pH为6.2。发酵培养基组成150 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、10 g/L牛肉膏、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种辅助筛选乳酸生产率高的乳酸菌的方法，包括如下步骤：　　　　１）培养待筛选样品，挑取产酸但不产气的菌株，获得产酸不产气菌株；　　　　２）培养所述产酸不产气菌株，挑取对数生长期内生长速率高于０．２ｈ↑［－１］的菌株，获得候选乳酸生产率高的乳酸菌；　　　　所述对数生长期内生长速率是按照如下公式计算的：Ｖ＝（ＯＤ↓［１］－ＯＤ↓［０］）／Δｔ；　　　　ＯＤ↓［０］为对数生长期内检测起始时间点对应的ＯＤ↓［６００］值；　　　　ＯＤ↓［１］为对数生长期内检测终止时间点对应的ＯＤ↓［６００］值；　　　　Δｔ为终止时间点至起始时间点之间的时间段。　　　　Ｖ为对数生长期内生长速率。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐洪涛，张延平，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]