一种对SARS-CoV-2病毒滴度进行测定的方法技术

本发明专利技术公开了一种对SARS

【技术实现步骤摘要】
一种对SARS
‑
CoV
‑
2病毒滴度进行测定的方法


[0001]本专利技术涉及生物学
，具体涉及一种对SARS
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CoV
‑
2病毒滴度进行测定的方法。

技术介绍

[0002]SARS
‑
CoV
‑
2病毒是一种新型冠状病毒，该新型冠状病毒具有高传染性、高致病性、高变异性，人体感染后，可出现干咳、乏力、发热、腹泻、全身酸痛等症状，严重者可发生呼吸衰竭。为了加深对SARS
‑
CoV
‑
2病毒的研究，以促进人们对SARS
‑
CoV
‑
2病毒的有效防治，常需对SARS
‑
CoV
‑
2病毒滴度进行测定，因此，需要一种精确、安全、稳定的对SARS
‑
CoV
‑
2病毒滴度进行测定的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种对SARS
‑
CoV
‑
2病毒滴度进行测定的方法，该对SARS
‑
CoV
‑
2病毒滴度进行测定的方法的测定结果精确、稳定，测定过程安全。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]一种对SARS
‑
CoV
‑
2病毒滴度进行测定的方法，包括以下步骤：
[0006]S1、在生物安全柜中准备好洗板过程中需要用到的操作用品，并将操作用品经紫外照射30min以上；
[0007]S2、依次进行VEROE6细胞培养、96孔板VEROE6细胞培养、病毒液稀释、洗细胞板、病毒吸附和培养；
[0008]S3、操作结束后，进行清场与消毒；
[0009]S4、感染病毒后24h观察细胞病变情况，每隔12h观察一次，并记录观察结果，直至观察结果趋于稳定时结束观察；
[0010]S5、基于最终的观察结果，进行SARS
‑
CoV
‑
2病毒的TCID
50
滴度计算。
[0011]优选地，步骤S2中所述VEROE6细胞培养的具体过程为：采用T25细胞培养瓶对VEROE6细胞进行培养，以10％FBSDMEM培养基培养2d至90～100％，进行传代。
[0012]优选地，步骤S2中所述96孔板VEROE6细胞培养的具体过程为：按1个T25细胞培养瓶传1个96孔板密度接种VEROE6细胞，分别在板上标记细胞名称，于37℃，5％CO2条件过夜培养，次日待细胞成单层细胞后感染病毒。
[0013]优选地，步骤S2中从
‑
80℃冰箱取出单独分装的500ul体积病毒原液，准备1.5mlEP管，将待测病毒原液进行10倍比例稀释，病毒液稀释的具体过程为：吸取100ul待测病毒原液加入到已加入900ul病毒稀释液的A管中，多次吹打混匀得到A液；换新枪头，枪头尖部吸取100ulA液，加入到B管中，枪头尖部浸入液面吸吹一次，换新枪头混匀得到B液；依次进行多个系列稀释，每个样本做11个稀释度，每个稀释度做8个复孔，每个样本设置细胞对照孔与病毒对照孔各4孔；稀释度的终止梯度根据实际病变情况或参考Ct值进行设置。
[0014]优选地，步骤S2中所述洗细胞板的具体过程为：从培养箱中拿出96孔细胞培养板，
用排枪吸弃原细胞培养液，用180ul/孔PBS洗细胞板两次，每次加入PBS后摇晃清洗，并将细胞培养板于紫外线消过毒的吸水纸上倒扣轻拍多次至液体完全流出。
[0015]优选地，步骤S2中所述病毒吸附和培养的具体过程为：按96孔细胞板设计加样，病毒对照孔加入100ul/孔病毒原液，细胞对照孔加入100ul/孔病毒稀释液，加入病毒时注意避免吸有病毒液的枪头在96孔细胞上面经过，防止结果出现跳孔。
[0016]优选地，步骤S3的具体过程为：操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用含75％酒精或适合的消毒液擦拭外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中；未使用完的感染性生物材料进行销毁或放入生物安全三级实验室
‑
20℃冰箱，并如实填写操作和处理记录；将实验区内的污染材料进行高压处理；用消毒液擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面，继续运行20min后关闭风机。
[0017]优选地，步骤S4的具体过程为：
[0018]S41、计算各病毒稀释度阳性孔数目和阴性孔数目；
[0019]S42、计算阳性孔累积数和阴性孔累积数，阳性孔累积数由下向上累积，阴性孔累积数由上向下累积；
[0020]S43、计算阳性孔的百分比，其计算公式为：
[0021]阳性孔的百分比＝阳性孔累积数/(阳性孔累积数+阴性孔累积数)
×
100％；
[0022]S44、计算距离比例，其计算公式为：
[0023]距离比例＝(大于50％的阳性百分比
‑
50)/(大于50％的阳性比
‑
小于50％的阳性百分比)
[0024]LogTCID
50
＝大于50％的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例
×
Log稀释系数
[0025]TCID
50
滴度＝10+LogTCID
50
。
[0026]采用上述技术方案后，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术首先在生物安全柜中准备好洗板过程中需要用到的操作用品，并将操作用品经紫外照射30min以上；接着，依次进行VEROE6细胞培养、96孔板VEROE6细胞培养、病毒液稀释、洗细胞板、病毒吸附和培养，操作结束后，进行清场与消毒；然后，感染病毒后24h观察细胞病变情况，每隔12h观察一次，并记录观察结果，直至观察结果趋于稳定时结束观察；最后，基于最终的观察结果，进行SARS
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CoV
‑
2病毒的TCID
50
滴度计算；该对SARS
‑
CoV
‑
2病毒滴度进行测定的方法的测定结果精确、稳定，测定过程安全。
附图说明
[0027]图1为本专利技术以8个稀释度进行病毒液稀释的示意图。
具体实施方式
[0028]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0029]实施例
[0030]如图1所示，一种对SARS
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CoV
‑
2病毒滴度进行测定的方法，包括以下步骤：
[0031]S1、在生物安全柜中准备好洗板过程中需要用到的操作用品，并将操作用品经紫
外照射30min以上；
[0032]S2、依次进行VEROE6细胞培养、96孔板VEROE6细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对SARS
‑
CoV
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2病毒滴度进行测定的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、在生物安全柜中准备好洗板过程中需要用到的操作用品，并将操作用品经紫外照射30min以上；S2、依次进行VEROE6细胞培养、96孔板VEROE6细胞培养、病毒液稀释、洗细胞板、病毒吸附和培养；S3、操作结束后，进行清场与消毒；S4、感染病毒后24h观察细胞病变情况，每隔12h观察一次，并记录观察结果，直至观察结果趋于稳定时结束观察；S5、基于最终的观察结果，进行SARS
‑
CoV
‑
2病毒的TCID
50
滴度计算。2.如权利要求1所述的一种对SARS
‑
CoV
‑
2病毒滴度进行测定的方法，其特征在于，步骤S2中所述VEROE6细胞培养的具体过程为：采用T25细胞培养瓶对VEROE6细胞进行培养，以10％FBSDMEM培养基培养2d至90～100％，进行传代。3.如权利要求1所述的一种对SARS
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CoV
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2病毒滴度进行测定的方法，其特征在于，步骤S2中所述96孔板VEROE6细胞培养的具体过程为：按1个T25细胞培养瓶传1个96孔板密度接种VEROE6细胞，分别在板上标记细胞名称，于37℃，5％CO2条件过夜培养，次日待细胞成单层细胞后感染病毒。4.如权利要求1所述的一种对SARS
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CoV
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2病毒滴度进行测定的方法，其特征在于，步骤S2中从
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80℃冰箱取出单独分装的500ul体积病毒原液，准备1.5mlEP管，将待测病毒原液进行10倍比例稀释，病毒液稀释的具体过程为：吸取100ul待测病毒原液加入到已加入900ul病毒稀释液的A管中，多次吹打混匀得到A液；换新枪头，枪头尖部吸取100ulA液，加入到B管中，枪头尖部浸入液面吸吹一次，换新枪头混匀得到B液；依次进行多个系列稀释，每个样本做11个稀释度，每个稀释度做8个复孔，每个样本设置细胞对照孔与病毒对照孔各4孔；稀释度的终止梯度根据实际病变情况或参考Ct值进行设置。5.如权利要求1所述的一种对SARS
‑
CoV

【专利技术属性】
技术研发人员：郭志南，郑靖，尹君，李莉，张怡盾，康闻宇，蒋丽娜，邱汉泉，洪超，王晓波，温慧欣，唐飞，
申请(专利权)人：厦门市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：