一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物以及其应用。所述引物序列包括ｗｍｃ４１９和ｂａｒｃ１８１两组引物，与提供的引物序列形成的ＳＳＲ标记Ｘｗｍｃ４１９和Ｘｂａｒｃ１８１紧密连锁的抗叶锈病基因对我国目前流行的大多数叶锈菌生理小种表现抗病。利用该分子标记可以对该抗病基因进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。另外筛选方法也简单易行，便于操作，该引物及其应用将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物以及其应用。(二)
技术介绍
小麦叶锈病是一种世界性病害，其分布范围比条锈病和秆锈病更广。小麦 叶锈病菌适应不同的气候条件，可在全世界不同的小麦种植区发生，若条件适宜可造成40。/。甚至更大的产量损失(Knott 1989)。在我国，小麦叶锈病过去主 要在西南及长江流域的部分地区如贵州、江西等省发生较重，近年来华北、西 北及东北各地也日趋严重。在我国1969年、1973年、1975年和1979年曾凡 度大面积流行，造成严重减产。1998年，小麦叶锈病在全闺较大范围内流行， 山东鲁西南等地发病严重，后期病叶率达70- 80%，严重的达100%，部分田 块减产20%以上。利用抗叶锈品种是减轻叶锈病危害的最经济、有效、快捷的 方法。目前已有60个抗叶確秀病基因正式命名(Mcintosh et al. 2007)。其中大多 数具有生理专化性，这些抗病基因往往会由于病菌小种的变异而很快"丧失"抗 性。育种学家和植病学家希望通过利用多基因聚合、基因布局和多系品种来延 长苗期抗病基因的抗性寿命。要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须 有丰富的有效抗源，目前已知的有效抗病基因l又有Zr9，丄W9， Zr^/和因 此寻找和发掘新的抗源异常重要。 目前，在寻找和发掘抗源的过程中，分子标记技术使用较为广泛，特别是 在小麦的基因作图中得到了广泛应用。分子标记包括.RAPD、 RFLP、 SSR和 RGAP,近年来，利用分子标记定位和标记了多个小麦抗叶,秀病基因。其中SSR 标记由于其多态性高、共显性、稳定性好及染色体位置清楚而得到了广泛应用， 紧密连锁的SSR标记可用于标记辅助选择和聚合育种。在利用分子标记进行抗 性筛选和鉴定的过程中，特异性的引物是关键。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于小麦叶锈病抗性筛选的引物及其应用。本专利技术采用的技术方案如下一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物序列，它包括wmc4.19和barcl81两 组引物， 其中 wmc419的上游引物序列为 5'-GTTTCGGATAAAACCGGAGTGC-3', 下游引物序列为 5'-ACTACTTGTGGGTTATCACCAGCC-3'; barcl81 .的上游引物序列为 5'-CGCTGGAGGGGGTAAGTCATCAC-3'，下游引物序列为 5'-CGCAAATCAAGAACACGGGAGAAAGAA -3，。如上所述的引物序列是从美国农业部网站公开的多个SSR引物中进行多次 试验筛选得到的，在筛选小麦叶锈病抗性方面有很好的应用效果。具体应用为 以待测小麦基因组DNA为模板、wmc419和barcl81为引物进行PCR扩增， 再对扩增产物进行^r测，若扩增产物中含有153bp和165bp大小的条带，则待 测小麦有叶锈病抗性。本专利技术所提供的用于筛选抗叶锈病小麦的分子标记分别是IwmcW9和 ^Zwr/W，标记Xwm"79由引物wmc419扩增获得'(153bp ),标记^Zwc/S7 由引物barcl81扩增获得(165bp )。本专利技术中具体4企测方法如下；1 )提取待测小麦基因组DNA为模板；2 )以wmc419和bare 181为引物、待测小麦基因组DNA为模板，进行PCR扩增'20pL PCR反应体系组成如下待测小麦基因组DNA20 100ng, Taq酶0.5~1.2U,上下游引物(4pmol'I/1) 各0.5 1.5pL, dNTP (lOmmol.I/1) 0.2 0.6 ^L, 10xPCR緩冲液2 pL，余量为无菌蒸馏水； 优选组成如下待测小麦基因组DNA60 ng , Taq酶1U ，上下游引物(Aiimol'L") 各1.2)iL， dNTP (lOmmol'I/1) 0.4^L， 10xPCR緩冲液2 jiL,余量为无菌蒸馏水。PCR反应条件为94。C预变性4min，随后94。C变性lmin, 60°C (wmc419) 或58。C (barcl81 )退火lmin， 72。C延伸lmin,进4亍35个循环；最后72。C延 伸10min, 4 。C保存；3)对扩增产物进行分离检测在扩增产物中加入变性载样指示剂，94。C变性 10min后冷却，具体可于冰水混合物中冷却，然后在浓度为6%的变性聚丙烯 酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，'若扩增产物中含有153bp和165bp大小的条 带，则待测小麦有叶锈病抗性。所述变性载样指示剂组成为98% (v/v)无离子曱酰胺，10mM EDTA (pH8.0) ， 0.25% (w/v)溴酚蓝，0.25% ( w/v) 二曱苯氢氟，溶剂为蒸馏水。本专利技术方法中引物wmc419和barcl81分别扩增出SSR标记Xwm"/9和 ^Zwc/W ，标记ZwwcW9和^YZwr7S7与叶锈病抗性基因的连锁距离分别为 4.8cm和6.1cm;该标记是从1984年育成的小麦品系周8425B和中国春杂交产 生的F,、 F2和F3群体进行遗传分析和分子标记后找到的，与抗叶锈病基因紧 密连锁。利用该分子标记可以对抗病基因进行标记辅助选择，还可实现多个有 效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。Xwmc419和Xbarcl81与叶4秀病抗病基因紧密连锁可通过以下实验证实用强毒力叶锈菌生理小种THTT对小麦材料周8425B (由河南省周口市农 科院选育)和中国春(亲本)的Fi、 F2和F3代群体进行苗期抗病性鉴定，共 鉴定F,群体16林，F2群体286抹，125个F3家系，周8425B表现中抗，中国 春表现感病，Fi全部抗病，F2中有208林表现抗病，78 4朱表现感病，抗感分 离符合3: 1 (x2=0.79， P>0.25 ) ; 125个F3家系中27个家系表现纯合抗病， 65个家系表现抗感分离，33个家系表现为感病，F;j家系分离比例为纯合抗 抗感分离纯合感=1: 2:1 " =0.78， P>0.5 )，这表明周8425B中含有" 个显性抗病基因。从F2代单抹中选用20个抗病单抹和20个感病单抹分别组成 #元病;也和感病池。以周8425B、中国春、抗病池和感病池的基因组DNA为模板，进行PCR扩 增以及扩增产物的检测，PCR^应体系、扩增方法以及检测方法同本专利技术中 的扩增体系及方法；结果表明标记Xwmc419和Xbarcl81在亲本和抗感池之间有多态性，用标 记Xwmc419和Xbarcl81对抗感亲本.、抗感池和F2群体单抹的检测结果如图.1 和图2所示(Pl为周8425B， P2为中国春，Br为抗病池，Bs为感病池，R为 抗病单林，S为感病单株)，用标记Xvvmc479检测出现了 3种电泳带型，分别 称为带型A、 B和H(杂合带型)，周8425B、抗病池和抗病单抹可扩增出大 约153bp的DNA片段，见图1中带型A， P2、感病池和感病单抹可扩增出大 约135bp的DNA片段，见图1中带型B;用标记^&wcM7检测出现了 3种电 泳带型，分别称为带型A、 B和H(杂合带型)，周8425B、抗病池和抗病单 抹可扩增出大约165bp的DNA片段，见图2中带型.A， P2、感病池和感病单 抹可扩增出大约185bp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物序列，其特征在于所述引物序列包括ｗｍｃ４１９和ｂａｒｃ１８１两组引物，其中ｗｍｃ４１９的上游引物序列为：５′－ＧＴＴＴＣＧＧＡＴＡＡＡＡＣＣＧＧＡＧＴＧＣ－３′，下游引物序列为：５′－ＡＣＴＡＣＴＴＧＴＧＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＡＧＣＣ－３′；ｂａｒｃ１８１的上游引物序列为：５′－ＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＡＧＴＣＡＴＣＡＣ－３′，下游引物序列为：５′－ＣＧＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡ－３’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑天存，何中虎，夏先春，李新平，杨光宇，殷贵鸿，韩玉林，黄峰，王丽娜，
申请(专利权)人：周口市农业科学院，中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]