转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转基因水稻ＴＴ５１－１转化事件外源载体整合位点全序列及其应用，涉及生物工程技术领域中转基因水稻的安全评估和检测。本发明专利技术以转基因抗虫水稻品种ＴＴ５１－１为材料，提取基因组ＤＮＡ为模板，分四段扩增出包含旁侧水稻基因组序列的ＴＴ５１－１事件全序列，如ＳＥＱ　ＮＯ．１所示，由来源于水稻基因组的第１至６７３个碱基，来源于载体序列的第６７４至９３６４个碱基和来源于水稻基因组的第９３６５至１０５３６个碱基共同组成；本发明专利技术适用于对转基因水稻ＴＴ５１－１（包括亲本、杂种Ｆ１和后代）及其制品（包括植株、组织、稻谷、大米及其制品）实施检测、监测和安全管理。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
中转基因水稻的安全评估和检测，具体地说， 涉及一种转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用。
技术介绍
近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种 植和生产，有的被加工成食品、饲料或用作食品添加剂。由于转基因产品的生态 安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制 度。转化事件包含的转化载体的序列、编码基因序列、重组方式、插入位点等序 列信息是进行转基因安全评价的基础。根据这些信息，可以获得该转基因品系编 码的蛋白的序列、完整性、编码蛋白的组织和时间特异性，并进一步分析其潜在 的毒理特征、致敏性等安全性问题。同时，根据外源载体插入的位点，判断宿主 基因组插入失活和缺失的情况，可以推测该转化事件对宿主的影响和导致的安全 性问题。同时，序列资料也是转基因产品身份验证和检测的基础。只有建立了有效的 检测方法，才能对转基因产品的研究和生产进行有效的管理和监督。根据转基因 产品中外源基因的序列信息，外源基因在转基因构建体上的组合方式，以及构建 体在基因组上的整合位点，可以采用基因特异性、载体特异性和事件特异性的检 测方法。1、 基因特异性检测方法由于大量的转基因载体使用了相同的外源基因，因此基因特异性检测方法并 不适合当前转基因产品不断涌现的现实。2、 载体特异性检测方法载体特异性检测方法利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用 类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研 宄者所使用。但是，由同一构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可 能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此载体特 异性检测方法不能识别不同的转基因品系，也不能判别该转基因品系是否己经过 安全评估。3、事件特异性的检测方法事件特异性检测的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具 有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不 可重复的。因此，根据不可重复的整合位点特征序列，开发出了事件特异性的检 测方法。与前两种方法相比，事件特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基 因产品的定性和定量检测。但转基因构建体的完整信息通常难以获得，而已知序 列基因元件可能距边界有相当的距离，而且在整合的过程中，载体和基因组之间 可能发生复杂的重组，因此，分离旁侧序列成为事件特异性检测的关键。2000 年2月，欧盟为此资助了 Qpcrgmofood European Project项目，该项目现已成 功分离获得多个品种旁侧序列并用于建立事件特异性检测方法。当前，事件特异 性检测方法已经被用于转基因Roundup Ready soybean, Mon810 maize等一系列 转基因商品化品种的检测。经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因水稻TT51-1事 件外源插入载体全序列及两侧旁侧序列和利用此序列建立事件特异性定性、定量 PCR (聚合酶链式反应)检测的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有技术在转基因水稻TT51-1事件和转基因水稻 TT51-1衍生品种安全评估和检测工作中存在的不足，提供一种转基因水稻 TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用。本专利技术的目的是这样实现的一、转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列 本专利技术以转基因水稻品种TT51-1为材料，提取基因组DNA，并利用引物FraglF : 5，AAAAGTTGMTTTGGGMTAGTCAGCCA 3， 和引物FraglR : 5， CTCACCCAGAAACGCTTTACGG 3'扩增出包含TT51-1事件5'端673bp水稻基因序 列和部分TT51-1事件的全长3403bp的片段1;利用片段1内部引物Frag2F: 5' AATATAMCCATGCTCACTCA3，和引物Frag2R: 5， CGGTTTCMTGCGTTCTCCACCAAGTA 3'扩增出包含TT51-1事件的长2202bp的片段2;利用片段2内部引物Frag3F: 5， MTCCCTCAGCATTGTTCATCG 3， 和引物 Frag3R: 5， AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT 3'扩增出包含TT51-1事件的长3043bp的片段 3;利用片段3内部引物Frag4F: 5， AGAGGTGGCGMACCCGACAGGACTAT 3，和引 物Frag4R: 5， ATCTATTTGTTAGATACGTATGTTTATAGATCAC 3，扩增出包含TT51-1 事件的长2659bp的片段4;根据分离获得的4个片段，拼接出一种转基因水稻 TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列(简称本序列)，该系列包含TT51-1 事件及其两侧水稻基因组序列的长10536bp的全长序列，如SEQ NO. 1。转基因水稻TT51-1事件外源插入载体全序列及其两侧旁侧序列，其特征是1、 碱基序列如SEQ NO. 1所示，由来源于水稻基因组的第1至673个碱基， 来源于载体序列的第674至9364个碱基和来源于水稻基因组的第9365至10536 个碱基共同组成；2、 由来源于外源插入载体的第1至673个碱基和来源于油菜基因组序列的 第674至9364个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插入载 体5'端边界旁侧序列；3、 由来源于油菜基因组序列的第674至9364个碱基和来源于外源插入载体 的第9365至10536个碱基共同组成的DNA序列，转基因水稻TT51-1事件外源插 入载体3'端边界旁侧序列；4、 以上所述序列是转基因水稻TT51-1事件的特征序列，可以用于区分转基 因水稻TT51-1和其他转基因和非转基因水稻，以及转基因水稻TT51-1的定性检 测和定量分析。二、转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列的应用 1、利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特异 性定性PCR检测方法合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAMAGGAATA 3，和TT511V:5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，；提取样品总DNA，分别利用TT511G/TT511V 引物组合进行PCR扩增；PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存 在扩增产物，如存在扩增产物则说明样品中含有TT51-1来源的成分。2、利用该序列特征设计的转基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特异 性定量PCR检测方法合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA 3，和TT511V: 5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，； 合成TaqMan探针序列如下TT511P: 5， FAM —ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG —朋Q1 3，;提取样品总DNA，分别利用上述引物 TT511G/TT511V和探针TT511P组合进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1 基因组DNA被相同浓度非转基因水稻基因组DNA稀释至不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因水稻ＴＴ５１－１转化事件外源载体整合位点全序列，其特征是：　　　　碱基序列如ＳＥＱ　　ＮＯ．１所示，由来源于水稻基因组的第１至６７３个碱基，来源于载体序列的第６７４至９３６４个碱基和来源于水稻基因组的第９３６５至１０５３６个碱基共同组成；　　　　由来源于外源插入载体的第１至６７３个碱基和来源于油菜基因组序列的第６７４至９３６４个碱基共同组成的ＤＮＡ序列，转基因水稻ＴＴ５１－１事件外源插入载体５’端边界旁侧序列；　　　　由来源于油菜基因组序列的第６７４至９３６４个碱基和来源于外源插入载体的第９３６５至１０５３６个碱基共同组成的ＤＮＡ序列，转基因水稻ＴＴ５１－１事件外源插入载体３’端边界旁侧序列；　　　　以上所述序列是转基因水稻ＴＴ５１－１事件的特征序列，可以用于区分转基因水稻ＴＴ５１－１和其他转基因和非转基因水稻，以及转基因水稻ＴＴ５１－１的定性检测和定量分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢长明，吴刚，武玉花，肖玲，曹应龙，李均，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]