多氧霉素B的定量分析检测方法技术

本发明专利技术公开了一种多氧霉素Ｂ快速定量分析的检测方法，该检测方法包括：建立牛津杯法测定多氧霉素Ｂ的条件，并用多氧霉素Ｂ的标准溶液在生物检测条件下绘制一条线性回归曲线，然后利用牛津杯鉴定各阶段的发酵液所产生的抑菌圈大小，从而测得多氧霉素Ｂ在发酵液中的含量。本发明专利技术解决了目前在工业发酵生产多氧霉素Ｂ中存在的检测不方便、ＨＰＬＣ方法操作繁琐、劳动强度大、分析时间长、费用较贵等缺点，本方法可用于工业化发酵生产的多氧霉素Ｂ的检测中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种药物
的检测方法，具体地，涉及一种多氧霉素B 的定量分析检测方法。
技术介绍
多氧霉素(polyoxin)是由日本理化研究所为首的科研机构开发、并于1967 年获登记的农用抗生素。从可可链霉菌阿苏变种(Str印tomyces cacaoi var. asoensis)发酵产生的多氧霉素主要为两种成分多氧霉素A和多氧霉素B， 但多氧霉素A几乎没有活性；而其B成分即多氧霉素B (polyoxin B)是一类 广谱的抗真菌农用抗生素，由于它是一种高效、低毒、无环境污染的安全农药， 所以被广泛应用于粮食作物、特用作物、水果和蔬菜等重要病害的防治。在抗生 素发酵过程中产物检测方法的建立是至关重要的环节。目前己报道的多氧霉素B的检测方法主要为HPLC法(孙忠松，刘刚，牛增 元，马昕，用液相色谱二极管阵列检测器测定多氧霉素B，化学分析计量，1999 年，第8巻，第3期)。这种方法结果准确，但传统HPLC方法价格昂贵，要用各 种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的 居多，而且前期处理步骤多、过程复杂、分析时间长，在发酵生产中不便于对高 产菌株进行大量初筛以及对发酵过程中的产物进行动态监控。抗生素的生物鉴定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准， 具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。牛津杯法是琼脂扩散法中的 一种，其原理为①利用抗生素在摊布的含有特定试验菌的琼脂培养基内进行球 型立体扩散；②形成一定浓度的含有抗生素的肉眼可观察到透明抑制圈，抑制了 试验菌的繁殖；③抗生素的浓度不同，抑菌圈的大小也不同，比较供试品与样品 的抑菌圈直径，可得供试品含量。然而在多氧霉素B发酵过程的动态监控中， 至今还未见有关生物检测方面的报道。由于在整个生物检测过程中影响实验结果的因素很多，如检测平板的厚度、培养的温度、牛津杯的加液量以及菌悬液的浓 度等，其中一个环节操作不当或因素被忽略，就有可能导致该检测方法的失败。 因此如何建立起一套直观、准确、快速、测试简单并且费用低廉的定量分析检测 方法成为目前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种多氧霉素B的定量分 析检测方法。本专利技术对于多氧霉素B的检测方法可以应用于多氧霉素B工业发 酵生产中，包括在高产菌株的初筛阶段以及对发酵产物进行动态监控。与背景技 术中使用HPLC方法对多氧霉素B进行检测的方法相比，具有灵敏、快捷、操作 简单、原料价廉且相关性好的特点。本专利技术是通过以下技术方案实现的(1) 确立牛津杯法测定多氧霉素B的生物检测条件平板厚度为底层培养基 20tnL，上层培养基5mL;培养温度为30-32°C;牛津杯的加液量为200 u L;加菌 层培养基的菌悬液浓度为5X106cfu/ml;(2) 标准曲线的建立在步骤(l)的生物检测条件下，取多氧霉素B的标品和 样品溶于缓冲液中，用牛津杯法测定在不同浓度时抑菌圈的直径大小，并用抑菌圈直径为横坐标，多氧霉素B浓度的对数值为纵坐标，绘制标准曲线；(3) 产多氧霉素B菌株的摇瓶发酵及发酵液的后处理将产多氧霉素B的菌株的孢子在固体培养基上培养至孢子成熟，然后将成熟孢子接种于种子培养基 中，摇瓶培养后再将活化的种子接种到发酵培养基中培养并取样，最后将发酵液离心并用氯仿抽提；(4) 牛津杯法测定发酵液中多氧霉素B的含量，步骤包括在平板上加20mL 底层培养基和5 mL加菌层培养基，在加有底层和加菌层培养基的平板上放置牛 津杯，然后将歩骤(3)中所述经氯仿抽提处理后的发酵液滴加到牛津杯中，其中牛 津杯的加样量为200 y L，随后将滴加抗生素的平板放入培养箱中在30-32。C下进 行培养，最后用游标卡尺测量抑菌圈的直径，根据标准曲线测得多氧霉素B在 发酵液中的含量。本专利技术通过确定用牛津杯法检测多氧霉素B方法的最佳生物检测条件，并用多氧霉素B的标准溶液在此最佳生物检测条件下绘制一条线性回归曲线，然 后利用牛津杯鉴定各阶段的发酵液所产生的抑菌圈大小，利用线性回归曲线测得 多氧霉素B在发酵液中的含量。本专利技术使用牛津杯方法对多氧霉素B进行检测，解决了当前在工业发酵生 产多氧霉素B中存在的检测不方便、HPLC的操作繁琐、条件苛刻、劳动强度大、 分析时间长、费用较贵等缺点。同时通过与HPLC检测作比较，本专利技术中的方法 提供了一种直观、测试简单、费用低廉的多氧霉素B的快速定量分析检测方法， 有利于提高筛选成功率，满足高通量筛选的需要，可用于工业化发酵生产中对多 氧霉素B的快速定量检测。同时，本专利技术的检测方法可用于抗生素的定量分析， 便于进行抗生素合成和分离纯化过程中的活性检测以及产品质量标准的建立。本专利技术所涉及的菌株可可链霉菌阿苏变种NRC-19已在参考文献(E1-Shahed Kamal Y. I.等Egyptian Journal of Microbiology 1994,29(3) :315-328)中公 开。附图说明图1牛津杯法和HPLC法在发酵过程中对各阶段发酵液中多氧霉素B的检 测结果的对比图具体实施例方式以下结合附图对本专利技术的实施例作详细说明本实施例在以本专利技术技术方 案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限 于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。实施例1:步骤l、牛津杯法多氧霉素B的测定条件的确立测定条件取多氧霉素B的标准品于磷酸盐缓冲液中，调pH值为4.0，再 分别依次稀释到终浓度为lyg/mL， 5ug/mL， 10iig/mL， 25ixg/mL， 50ug/mL， 100ug/mL， 250ug/mL， 500ug/mL， 750ug/mL， 1000yg/mL，用牛津杯法测定 在不同浓度时抑菌圈的直径大小，并用抑菌圈直径为横坐标，多氧霉素B浓度 的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的斜率表示测量的偏差(估计值与真实值的接近程度)，其值越小，则表示多氧霉素B效价的增加幅度一定时， 抑菌圈直径的差异越大，意味着检测时准确度较高。标准曲线的x轴截距则反 映出在最低多氧霉素B效价下，各种情况的抑菌圈直径的大小，即测定的灵敏度。多氧霉素B浓度在10 500yg/mL时，其对数值与抑菌圈直径有较好的线 性关系，因此标准曲线范围可选为10 500ug/mL。在此范围内，确立了如下所 示的牛津杯法测定多氧霉素B的条件① 平板厚度的确立通过变换不同的底层和上层培养基的配比，依次制成 底层培养基和上层培养体积分别为20 mL和5 mL; 15 mL和5 mL; 15 mL和 10 mL; 10 mL和lOmL (前后两个数字分别代表底层和上层培养基的体积)的平 板各一套，3(TC培养24小时后绘标准曲线，各曲线斜率比较接近，即对检测的 准确度影响不大，但对同一底层而言，较小的上层培养基加量其灵敏度较高，这可 能是由于提高了指示菌的敏感性的缘故。因此采用底层培养基为20mL，上层培 养基为5mL时得到较好的结果。② 培养温度的确立采用5种不同的培养温度25°C， 28°C， 30°C， 32'C和 37 t:培养，24h后，在3(TC， 32'C和3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多氧霉素Ｂ的定量分析检测方法，其特征在于，包括如下步骤：　　　　（１）确立牛津杯法测定多氧霉素Ｂ的生物检测条件：平板厚度为底层培养基２０ｍＬ，上层培养基５ｍＬ；培养温度为３０－３２℃；牛津杯的加液量为２００μＬ；加菌层培养基的菌悬液浓度为５×１０↑［６］ｃｆｕ／ｍｌ；　　　　（２）标准曲线的建立：在步骤（１）的生物检测条件下，取多氧霉素Ｂ的标品和样品溶于缓冲液中，用牛津杯法测定在不同浓度时抑菌圈的直径大小，并用抑菌圈直径为横坐标，多氧霉素Ｂ浓度的对数值为纵坐标，绘制标准曲线；　　　　（３）产多氧霉素Ｂ菌株的摇瓶发酵及发酵液的后处理：将产多氧霉素Ｂ的菌株的孢子在固体培养基上培养至孢子成熟，然后将成熟孢子接种于种子培养基中，摇瓶培养后再将活化的种子接种到发酵培养基中培养并取样，最后将发酵液离心并用氯仿抽提；　　　　（４）牛津杯法测定发酵液中多氧霉素Ｂ的含量，步骤包括：在平板上加２０ｍＬ底层培养基和５ｍＬ加菌层培养基，在加有底层和加菌层培养基的平板上放置牛津杯，然后将步骤（３）中所述经氯仿抽提处理后的发酵液滴加到牛津杯中，其中牛津杯的加样量为２００μＬ，随后将滴加抗生素的平板放入培养箱中在３０－３２℃下进行培养，最后用游标卡尺测量抑菌圈的直径，根据标准曲线测得多氧霉素Ｂ在发酵液中的含量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钟建江，孙力，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]