本发明专利技术涉及用微生物发酵生产Ｄ－核糖的微生物菌株以及用该菌株制备Ｄ－核糖的方法，属于微生物技术领域。其特征是以Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ为出发菌株，采用化学、物理等诱变剂处理细胞，获得莽草酸营养缺陷型突变株。用该突变株发酵生产Ｄ－核糖。本发明专利技术采用发酵法生产Ｄ－核糖在常温常压下进行，原材料来源广，价格低廉，对原材料中所含的芳香族氨基酸量，玉米浆制作方法无严格要求，并可改善化学合成法对环境造成的污染。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用微生物发酵法生产D—核糖的微生物菌种以及D—核糖生产方法，属于微生物
D—核糖是微生物体内核糖核酸的组成成份，又是还原型诱导物，在生理上是十分重要的物质。D—核糖在工业上一直是维生素B2的重要合成原料。近来，D—核糖作为调味品，调味品香料等合成原料，在食品工业上有广阔的应用前景。制造廉价的D—核糖，在工业上有广泛深远的意义。D—核糖的制造方法，有从天然物中抽提分离的方法，也有使用化学合成的方法制造。有机化学合成法制造核糖时，最早是采用一种汞极进行电解还原反应制得，此法会引起汞的污染。化学合成法经不断改进后，从葡萄糖经氧化、置换、转化、内酯化、还原等七步反应后获得D—核糖。这种化学合成法反应时间长，操作步骤复杂，所用设备多，制造成本高，收率低，并且会造成环境污染。在本专利技术完成前所公开一份技术中，用短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)突变珠的D—核糖生产菌，在其发酵原料上要采用特定的方法制备玉米浆，因为芳香族氨基酸的量控制着菌株的发酵。这种发酵方法工艺复杂，成本高。本专利技术的目的是采用紫外线、甲基磺酸乙酯等化学、物理诱变因子作为诱变源，对亲株进行定向诱变选育，获得莽草酸营养缺陷型突变株，改变了糖代谢途径。本专利技术的另一个目的是提供一种工艺简单、制造成本低，采用上述菌株制备D—核糖的发酵方法。本专利技术通过下列方案来实现本专利技术首先涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JSIM—1018突变株菌种。其特征是以Bacillus subtilis为出发菌株，用化学、物理等诱变剂处理细胞，获得莽草酸缺陷型突变株。该菌株在培养过程中菌体呈弯曲型、数字型及锁状结构。专利技术中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JSIM—1018突变株菌种，已于1995年9月19日保芷在中国微生物菌种保芷管理委员会普通微生物中心、登记入册的编号CGMCC NO.0238一、D—核糖产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JSIM—1018突变株的获得。1、菌种从28株不同类型的细菌Bacillus，Brevibacterium，Cory—nebacterium，Psendmonas，Arthrobacter中，经筛选有三株Bac—illus sp.菌株具有积累D—核糖的能力，最高的一株SM—18菌株，D—核糖积累量6.35mg/ml，其余均在3mg/ml以下。2、菌种诱变过程从三株积累D—核糖的B.subtilis菌株中，选择B.subtilisSM—18为亲株，将菌株在斜面上温度为25—32℃下，培养12—24小时制成菌悬液，细胞数为1×109个/ml，按常规诱变方法，用紫外线、甲基磺酸乙酯等物理、化学透变剂相间或连续处理。紫外照射时间0.5—3.0分钟，甲基磺酸乙酯最终浓度为0.5—2.0％，处理时间20—45分钟，经处理的细胞分别移种到含有和不含有莽草酸的基本培养基上，在温度为25—32℃下培养2—5天，检出含有莽草酸的基本培养基上生长，而无莽草酸的基本培养基上不生长的菌落，编号B．subtilis JSIM—1018冰箱保藏。基本培养基组成(％)．葡萄糖0.1—0.5；硫酸铵0.2；磷酸氢二钾1.4；磷酸二氢钾0.6；硫酸镁0.02；硫酸锰0.001；硫酸亚铁0.001；腺嘌呤40—60ug/ml；组氨酸40—60ug/ml；含莽草酸的基本培养基莽草酸含量40—60ug/ml。3、诱变选育获得的莽草酸营养缺陷型突变株，D—核糖积累量比亲株有极大地提高。然后经多次紫外线和甲基磺酸乙酯反复诱变处理，从突变株中不断选优，再经菌株的营养要求、培养条件多个方面的研究，获得了B.subtilis JSIM—1018菌株。二、B.subtilis新菌株制备D—核糖的方法B.subtilis发酵生产D—核糖方法主要是通过下列步骤来实现的(1)、斜面培养基(％)取葡萄糖0.1—0.5；蛋白胨0.5—1.0；酵母膏0.1—0.4；氯化钠0.1—0.4；琼脂1.5—2.5；PH为7.0—7.5，此培养基可按不同需要制作成试管斜面或茄子瓶大斜面。将冰箱保藏的菌种移种到斜面上，在温度30—34℃下培养24—48小时。(2)、种子培养基(％)取葡萄糖0.5—2.0；玉米浆0.5—2.0；磷酸氢二钾0.1—0.5；磷酸二氢钾0.1—0.5；硫酸镁0.1—0.5；硫酸锰0.005—0.01；PH为7.0—7.5。种子罐可以是碳钢或不锈钢制，最好为标准型。容量300升，装液量150—210升。转速250—350转/分。常规灭菌，发酵罐冷却至32—35℃，接入从大斜面上用无菌水洗下的菌种，所用的大斜面茄子瓶4—10只，在温度为28—36℃下，培养16—24小时。风量1∶0.25—0.5。(3)发酵培养基(％)取用玉米淀粉水解糖或玉米粉经淀粉酶、糖化酶双酶法制得的糖18—20；玉米浆0.5—2.0；硫酸铵0.5—1.0；酵母粉0.1—0.5；硫酸镁0.05—0.1；硫酸锰0.05—0.1；碳酸钙1—2.5；PH为7.5—8.0，发酵罐可以是不锈钢或碳钢制，最好为标准型。搅拌转速160—240转/分，容量3000升，装液量为1500—2100升。培养基灭菌可以把糖质原料单独分开消毒后与其它成份合并。也可混在一起直接消毒。时间4—8分钟，冷却至32—35℃接入种子罐中的全部种子，接种量5—10％。在温度为34—38℃下通风搅拌培养60—80小时，风量1∶0.4—0.8。发酵过程中测定的项目，D—核糖、葡萄糖、PH、O.D、CO2。每隔6小时测定。葡萄糖基本耗尽，D—核糖不再增长，CO2降至1以下，即可放罐。(4)、提取放罐后的发酵液调PH为7.5—10.5，加絮凝剂脱乙酰甲壳素或甲壳素，絮凝剂用量为发酵液总量的100—600PPM，此时，发酵液中的菌体颗粒、杂质变大，连结成絮状物，易与清液分开。经沉淀后用压滤，抽滤或离心除去菌体杂质得到发酵清液。清液上阳离子和阴离子交换树脂柱，除去发酵液中的盐类。用活性炭脱色，脱色液减压浓缩，浓缩温度不高于55℃，浓缩至30％以上的D—核糖糖浆备用。或者在浓缩后添加浓缩液4倍量的乙醇得到D—核糖结晶。下面的实施例对本专利技术作详细说明实例11、培养基配制(1)、斜面培养基(％)取葡萄糖0.5，蛋白胨1.0，酵母膏0.4，氯化钠0.1，琼脂2.0，定容到100毫升，PH7.2。(2)、种子培养基(％)玉米粉酶解糖2.0；玉米浆1.0；磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.2；硫酸镁0.1；硫酸锰0.005，定容到200升，PH7.2。(3).发酵培养基(％)玉米粉酶解糖18；玉米浆0.6；硫酸铵1.0；酵母粉0.2；硫酸镁0.1；硫酸锰0.01；碳酸钙2.0；定容到2000升，PH7.5。(4)、发酵将保藏的Bacillus subtilis JSIM—1018菌株接种至5只茄子瓶斜面上，30℃培养48小时，用无菌生理盐水，将斜面上菌苔洗下，在无菌条件下合并入血清瓶中，用压差法接入种子罐中。种子罐容积300升，装液量200升。转速250转/分，风量1∶0.5，在温度为35℃±1℃下，培养22小时，接入盛有发酵培养基2000升的发酵罐中，转速160转/分，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种发酵生产Ｄ－核糖新菌株，其特征是以Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ为出发菌株，采用化学、物理等诱变剂处理细胞，获得莽草酸营养缺陷型突变株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓崇亮，柏建新，
申请(专利权)人：江苏省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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