一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其检测方法技术

一种检测黄曲霉毒素Ｂ↓［１］的试剂盒及其检测方法用于对粮食、饲料及食品中黄曲霉毒素Ｂ↓［１］含量的检测。本发明专利技术配制试剂盒，并采用酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）竞争法检测ＡＦＢ↓［１］，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清。经过生化提纯分离出家兔免疫球蛋白将抗体吸附于酶标板孔中，温育后洗涤，加入样品提取液及酶标抗原，使两者进行反应，洗涤，加酶底物反应显色。本发明专利技术灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读，价格低廉，尤其适用于粮食，食品，饲料中黄曲霉毒素Ｂ↓［１］的检测。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其检测方法，用于对粮食、饲料及食品中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量的检测。由于黄曲霉毒素具有毒性大，致癌力强，含量低(通常0-200μg/Kg，即0-200PPb)和结构相似等特点，这就要求检测方法灵敏度高，特异性强，集分离与检测为一体，目前黄曲霉毒素的测定方法有多种，概括起来有化学分析法，仪器分析法，生物鉴定法及免疫分析法等。上述这些分析方法也是紧密相联的，它们之间没有绝然的分界线。免疫分析法中的酶联免疫吸附法(ELISA)是70年代出现的新的免疫测定技术。正如1994年《粮食与饲料工业》杂志中已报道，酶联免疫吸附法其原理是抗原(或抗体)吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标记的抗体(或抗原)与标本中的待测物(抗原或抗体)起特异的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。这一技术应用于黄曲霉毒素的测定大体为二类一是用双抗体夹心法检测样本中的黄曲霉毒素，如Sashidha将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白涂覆于酶标板孔穴中，经初步培养后，加兔的AFB1抗体和游离AFB1，用磷酸4-硝基苯酯作基质，以碱性磷酸酶-抗兔免疫球蛋白检测第一抗体的结合二是用竞争法检测样本中的黄曲霉毒素，如在涂抗体的孔穴中，用乙烷萃取黄曲霉毒素B1，并与结合辣根过氧化物酶的黄曲霉素B1交联物混合，37℃下培养10分钟后，用水洗除去未结合的黄曲霉毒素B1交联物，再加底物，在波长405nm进行检测。为得到特异性更强的ELISA法，发展了AFB1单克隆抗体的酶标记免疫吸附测定法，Kawamura用间接和直接竞争ELISA法分析AFB1检出限小于1ng。上述所讲的黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(酶标抗原)的中间体是用Adsorbosil-柱层析法来提纯，部分材料需进口，操作要求较严格，费用也较高。如采用薄层层析制备来提纯，其中的硅胶吸附能力较强，在层析分离产物AFB1-Oxime和原料AFB1时，洗脱比较困难，其产率低，而且洗脱时间较长。本专利技术的目的在于提供一种结构简单，使用方便，廉价，携带方便的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒。本专利技术的另一个目的是克服上述不足之处，从而提供一种样品前处理简单，提取后就可直接测定，不需要净化过程；一次可测定大量样本，而且简便，快速、灵敏、准确、廉价的检测黄曲霉毒素B1的方法。本专利技术试剂盒主要由盒体(1)，酶标板(2)，A试剂瓶(稀释液)(3)，B试剂瓶(标准AFB1试剂)(4)，C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液)(6)，E试剂瓶(含吐温20的PBS缓冲液)(7)，F试剂瓶(四甲基联苯胺试剂)(8)、G试剂瓶(H2O2溶液)(9)，H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10)，I试剂瓶(硫酸溶液)(11)、海棉托架(12)所组成，海棉托架(12)上制有孔及凹槽，上述A、B、C、D、E、F、G、H、I试剂瓶安装在海棉托架(12)的孔和凹槽内，海棉托架(12)酶标板(2)安装在盒体(1)内。本专利技术主要采用酶联免疫吸附(ELISA)竞争法来检测AFB1。采用ELISA竞争法的技术主要有两个方面。特异性抗体(多克隆或单克隆)的制备，利用抗原免疫家免，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，抗原-酶交联物(即酶标抗原)的制备。由于AFB1(黄曲霉毒素B1)不脂直接与酶结合，必须先将AFB1修饰，引入一个-COOH修饰基团，然后和酶的氨基反应，使其具有酶的活性，即能催化底物的显色反应。首先将多克隆(或单克隆)抗体包被在酶标板(2)上，酶标板(2)放在4℃左右冰箱过夜。再进行试剂及酶底物混合液的配制，在B试剂(标准AFB1中)加20-30mlA试剂混匀，在C试剂(酶标抗原)中加入10-20mlD试剂(无酶标抗原稀释液)，溶解、混匀，在2-8℃下保存，E试剂(含吐温20的PBS固体)中加入蒸馏水配制成洗涤液，用E洗涤液洗酶标板2-4次，洗液不得溢出，每次间隔0.5-1.5分钟，放在吸水纸上拍干，在酶标板小孔中加入配制好的试剂及样品稀释液进行竞争免疫反应，在37-38℃放置28-35分钟，再用洗涤液洗板4-6次，每次间隔1-2分钟，拍干，再加入酶底物混合液，混匀，在37-38℃放置13-18分钟，显色，最后加入I终止液(硫酸溶液)中止反应，测定。黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(B1-Oxime)的制备(中间体)(1)合成取20-30mg黄曲霉毒素B1，30-40mg羧甲基羟胺半盐酸盐于圆底瓶中，加入10-20ml吡啶甲醇的反应溶剂，回流2-4小时，再室温搅拌15-20小时，减压挥干溶剂，得固体。(2)、提纯在上述固体中加入5-10ml蒸馏水，采用0.1-0.5N碳酸氢钠调pH至碱性，转移至分液漏斗中，2-5ml氯仿萃取，静置分层，得水相层，再用0.1-0.5N盐酸调水相层至酸性，用4-8ml氯仿萃取，得氯仿层，用0.5-2ml蒸馏水洗氯仿层，弃去水层，减压蒸馏，挥干溶剂，得淡桔黄色固体。2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备(1)、合成取0.5-1.0mg黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)淡桔黄色固体溶于10-20ml的乙醇液中，混匀，依次加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐及5-10mg的辣根过氧化物酶，慢速搅拌15-30分钟，再加150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐，在2-8℃搅拌15-18小时，并在5000-10000转/分钟，离心5-10分钟，取上清液。(2)、提纯将上述上清液通过pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex层析柱，并用该缓冲液洗脱，部分收集器收集，洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值，绘制洗脱曲线，收集双峰并存的洗脱液，在pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液透析3-5天，得含黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)的溶液，小瓶分装冷冻干燥，得粉状固体。实施例1本专利技术主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测黄曲霉毒素B1的含量。具体操作步骤如下一、多克隆抗黄曲霉毒素B1抗体的制备1、免疫用抗原首次免疫用5ml黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白与5ml完全福氏佐剂混合后作为免疫抗原，加强免疫时取5ml黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白与5ml不完全福氏佐剂混合作为免疫抗原。2、免疫程序先将购买的新西兰大白免饲养数周后，在背部脊柱两侧脱毛区取5-10个接种点，每点内接种完全佐剂抗原0.2-0.3ml，然后每隔4周四肢肌肉加强接种不完全佐剂抗原1ml，共加强免疫2次。3、采血首先免疫前可取耳缘静脉采血，以后每次加强免疫前各采血1次，第二次加强免疫后第四周再采血一次，测定血清抗体效价后颈动脉放血。4、分离血清分别以30％和60％的硫酸铵分级沉淀血清中杂蛋白与抗体免疫球蛋白，离心后得含有抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体的溶液。二、单克隆抗黄曲霉毒素B1的制备1、抗原制备通过黄曲霉毒素B1的肟化反应和交联反应制备免疫用人工抗原黄曲霉毒素B1-羧甲基肟-牛血清白蛋白人工抗原(AFB1-Oxime-BSA)。2、免疫动物采用BALB/C小白鼠作为免疫动物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测黄曲霉毒素Ｂ↓［１］的试剂盒由盒体（１），酶标板（２）、Ａ试剂瓶（稀释液）（３）、Ｂ试剂瓶（标准ＡＦＢ↓［１］试剂）（４），Ｃ试剂瓶（酶标抗原试剂）（５），Ｄ试剂瓶（酶标抗原稀释液试剂）（６），Ｅ试剂瓶（含吐温－２０的ＰＢＳ固体）（７），Ｆ试剂瓶（四甲基联苯胺试剂（８），Ｇ试剂瓶（Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］溶液）（９），Ｈ试剂瓶（醋酸钠－柠檬酸缓冲液）（１０），Ｉ试剂瓶（硫酸溶液）（１１），海棉托架（１２）所组成，海棉托架（１２）内装有上述Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ试剂瓶，海棉托架（１２）及酶标板（２）均安装在盒体（１）内。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：成恒嵩，潘中华，宓晓黎，赵晓联，袁建兴，杨焱，殷旭仁，余传信，徐燕芳，葛其德，
申请(专利权)人：江苏省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]