用于免疫分析的方法及装置制造方法及图纸

一种至少在其一个表面上具有全反射棱镜的全反射池，将含有金溶胶标记的吸附到金溶胶上的抗体的混合液贮存到该全反射池中，然后将含有能与抗体发生抗原－抗体反应的抗原的样品液加入到其中以形成金溶胶标记的免疫复合物。将测定光束从入射光学系统以能够产生全反射的θ角引入到全反射棱镜中并且来自全反射棱镜的出射光束被测定光学系统接收，借此测定金溶胶标记的免疫复合物的吸收并对抗原进行定性和测定。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种在临床检验、生化样品测定、药物质量控制等领域中用于免疫分析测定目标的方法和装置。利用抗原-抗体反应的免疫分析方法包括荧光免疫测定法和发光免疫测定法。在这两者的任何一种方法中，都是使利用光物质或化学发光物质标记的抗原与带有在竞争中作测定目标的抗原的抗体反应，以便通过抗原-抗体反应形成一个免疫复合物(即分子配合物)，从而可测定来自标记物的荧光和发光，借此定量分析靶物质。另一方面，将作为测定目标的抗原或抗体加入到抗体或抗原中并测定通过抗原-抗体反应形成的免疫复合物对光的吸收或散射，借此进行定量分析的方法被称为一种既不利用荧光也不利用发光的光学测定法。利用光散射现象的定量分析方法包括比浊法和浊度测定法。前者适于测定被吸收和散射衰减的透射光，而后者适于测定散射光强度。利用光散射的方法适于测定与测定粒子大小相对应的瑞利(Rayleigh)散射和米(mie)散射。有人提议将属于荧光免疫测定法的荧光免疫测定装置作为采用全反射池的免疫测定装置(参见日本专利公报No.5-203574(1993))。在这种荧光免疫测定法中，将抗体固定在全反射棱镜的表面上，然后通过抗原-抗体反应使样品中所含的抗原结合到抗体上，再通过抗原-抗体反应使一种利用荧光物质标记的抗体再结合到这个抗原上。其后进行B-F分离以除去利用荧光物质标记的未反应的抗体，然后将激发光束导入全反射棱镜中以激发束缚在全反射棱镜表面上的被标记的抗原-抗体免疫复合物，从而测定由荧光物质所产生的荧光。利用光散射的方法(即单相免疫测定法)是一种既不需要B-F分离也不需要洗涤的简单方法。然而，利用瑞利散射或米散射的方法在测定低浓度的物质时具有检测灵敏度低和测定准确度差的缺陷。另一方面，荧光或发光免疫测定法需要利用荧光或发光物质来标记抗原或抗体的复杂的化学处理过程。而且，多数是多相免疫测定法，该测定法必然需要B-F分离，以便通过大量的分析步骤使发生抗原-抗体反应的免疫复合物(B)与未发生抗原-抗体反应的抗原或抗体(F)分离并进行洗涤。为了通过免疫复合物的吸收测定定性和定量分析免疫复合物，专利技术人进行了深入研究，发现虽然从免疫复合物本身得不到具有适于测定的灵敏度的吸收，但是当免疫复合物处于被贵金属溶胶粒子吸附的状态时能够在相当好的灵敏度下测定免疫复合物的吸收。本专利技术的一个目的是使得利用免疫复合物的吸收测定来定性或进一步测定免疫物质这样一种方法能够比荧光或发光免疫测定法更易于进行。按照本专利技术的免疫分析方法包括如下步骤使含有用贵金属溶胶粒子标记的抗体或抗原的溶液与样品溶液混合以形成样品混合溶液，从而使样品溶液中所含的抗原或抗体与被标记的抗体或抗原反应，借助形成贵金属溶胶标记的免疫复合物，然后利用一个至少在其一个表面上具有全反射棱镜的测定池并将波长在可见到红外区域范围内的测定光束以一个能够产生全反射的入射角度导入全反射棱镜中，借此测定在全反射棱镜和样品混合溶液之间的交界面处产生的测定光束的吸收。这样，就可定性或进一步测定样品中所含的抗原或抗体。可用金、银或铜溶胶制备贵金属溶胶，并且其合适的粒径为5-50nm。按照本专利技术，不分离用贵金属溶胶标记的抗体或抗原或者样品溶液中所含的抗原或抗体中的未反应的那一个也能够利用测定光束进行吸收测定，借此实施单相免疫测定分析。除此之外，通过利用贵金属溶胶还能进行高灵敏的测定。按照本专利技术适于实施上述方法的免疫测定装置包括一个在其壁面(限定出一个容纳样品混合液的空间)的至少一面上有一个全反射棱镜的全反射池，该棱镜由折射率比样品混合液的折射率大的材料制成；一个用于将波长在可见到红外区域范围内的测定光束以一个能够产生全反射的入射角度导入全反射棱镜中的入射光学系统；以及一个接收来自全反射棱镜的射出光束以测定样品混合液的吸收度的测定光学系统。根据被衰减的全反射的强度来测定全反射的吸收。可用一个容器型池或一个流动池来制成全反射池，所述容器型池只有一个开口以便在池中发生抗原-抗体反应形成贵金属溶胶标记的免疫复合物或在另一容器中进行抗原-抗体反应形成贵金属溶胶标记的免疫复合物，然后在这个容器型池中贮存含有贵金属溶胶标记的免疫复合物的样品混合液，所述流动池具有一个溶液入口和一个溶液出口以便在形成贵金属溶胶标记的免疫复合物之后将样品混合液加入其中。可用发射连续波长的光束的光源或用单波长光源(例如发射单波长光束的激光单元)形成包括在入射光学系统中的光源。当光源发射连续波长的光束时，虽然入射或测定光学系统必须包括一个分光镜，但是也可实施分光光度测定法。另一方面，如果采用单波长光源，则可只在光源的单一波长处进行吸收测定，而无需分光镜。当存在于全反射池中的样品混合液只包含用贵金属溶胶标记的抗体或抗原时，未能识别具有适于测定的灵敏度的吸收。当不用贵金属溶胶标记免疫复合物时，也未能识别出具有适于测定的灵敏度的吸收。只有当用贵金属溶胶标记的免疫复合物存在时才在一个特定的波长处识别出具有适于测定的灵敏度的吸收。本专利技术的特点就在于这一点，由此能够进行单相免疫测定分析。假设n2代表含有免疫复合物的样品混合液的折射率，n1(n2＜n1)代表全反射棱镜的折射率，产生全反射的临界角θc则表示如下θc＝Sin-1(n2/n1)当将来自入射光学系统的测定光束导入全反射棱镜中时，全反射棱镜与样品混合液之间界面处的入射角θ(参见附图说明图1)应满意下述条件θ＞θc当进行单相免疫测定分析时，被吸收测定的样品混合液是含有贵金属溶胶标记的抗体(或抗原)、贵金属溶胶标记的免疫复合物、未反应的抗原(或抗体)、生物聚合物以及类似物质的混合溶液。测定光束是在近红外、中红外以及远红外区域中的适当区域中包括一连续波长光束的光束，或者是一单波长光束。可用吸收度A如下表示全反射棱镜的吸收A＝N·α·de·loge在此处，N代表全反射棱镜中的全反射次数，α代表样品混合液的吸收系数，de代表在一次全反射中测定光束射入样品混合液所通过的光路长度。按照本专利技术，利用一全反射池高灵敏地测定存在于样品混合液中的贵金属溶胶标记的免疫复合物的吸收。只有在利用贵金属溶胶标记的免疫复合物中才能够测定到具有适于测定的灵敏度的吸收，而只在利用贵金属溶胶标记的抗体或抗原中或者在没有用贵金属溶胶标记状态的免疫复合物中测不到具有适于测定的灵敏度的吸收，由此利用由全反射测定的吸收而无需B-F分离即可进行免疫物质的定性和测定，同时通过简单的操作并利用简单的测定装置就可完成免疫测定。通过以下结合附图对本专利技术的详细描述，本专利技术的上述和其它目的、特征、情况及优点将变得更加显而易见。图1是本专利技术的一个实施例的示意图；图2是按照这个实施例的测定装置的方框图；图3是本专利技术中的金溶胶标记的免疫复合物和金溶胶标记的抗体的光谱图；图4是本专利技术中的金溶胶标记的免疫复合物和没有用金溶胶标记的免疫复合物的光谱图；图5是基于图3所示光谱描绘的本专利技术金溶胶标记的免疫复合物的全反射吸收光谱的差光谱；图6示出了在按照本专利技术的免疫测定法中，在2942.5cm-1处的吸收度对抗体IgG浓度的依从关系；图7示出了在按照本专利技术的免疫测定方法中，在2888.1cm-1处的吸收度对抗体IgG浓度的依从关系；图8示出了在按照本专利技术的免疫测定法中，在1112.4cm-1处的吸收度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定性或进一步测定样品中所含的抗原或抗体的免疫分析方法，包括如下步骤： 使含有用贵金属溶胶粒子标记的抗体或抗原的溶液与样品溶液混合以形成样品混合液。从而使所述样品溶液中含有的抗原或抗体与被标记的所述抗体或抗原反应，借此形成一个贵金属溶胶标记的免疫复合物； 将波长在可见到红外区域范围内的测定光束以一个能够产生全反射的入射角导入一个构成全反射池的全反射棱镜中，所述样品混合液存在于所述全反射池中；以及 测定在所述全反射棱镜与所述样品混合液之间的界面处产生的所述测定光束的吸收。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：窦晓鸣，山口佳则，上野山晴三，
申请(专利权)人：株式会社京都第一科学，
类型：发明
国别省市：JP[日本]