UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的生产方法技术

依照本发明专利技术，利用具有ＵＤＰ－Ｎ－乙酰葡糖胺４－差向异构酶活性的蛋白质可生产ＵＤＰ－Ｎ－乙酰半乳糖胺和含Ｎ－乙酰半乳糖胺的碳水化合物。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及UDP-N-乙酰半乳糖胺和含有N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的生产方法。某些含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物在癌细胞等中特异性表达，因而可用作抗癌治疗的抗癌疫苗等。进一步，由于脑中存在丰富的含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物，预计其可适用于提高脑功能。UDP-N-乙酰半乳糖胺可用作合成含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的底物。
技术介绍
关于UDP-N-乙酰半乳糖胺(以下缩写为UDP-GalNAc)的生产，已有公知的生产方法，其利用源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的无细胞提取物或部分纯化的酶。然而，上述方法生产UDP-GalNAc的得率低，且源自枯草芽孢杆菌的UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶(EC5.1.3.7，以下缩写为UDP-GlcNAc 4-差向异构酶)或编码UDP-GlcNAc4-差向异构酶的基因尚未详细说明。至于源自微生物的UDP-GlcNAc 4-差向异构酶，有报道指出源自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的WbpP蛋白具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶的活性，但尚无用蛋白质或编码该蛋白质的DNA来制备UDP-GalNAc的报道。另一方面，至于UDP-葡萄糖4-差向异构酶(EC 5.1.3.2)，已知源自仓鼠和人的酶也以UDP-GlcNAc为底物，但尚无报道显示源自大肠杆菌(Escherichia coli)的UDP-葡萄糖4-差向异构酶具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶的活性。另外，上文所提及的源自铜绿假单胞菌的WbpP蛋白与已知的UDP-葡萄糖4-差向异构酶没有同源性。源自下列微生物的已知蛋白质被认为是UDP-葡萄糖4-差向异构酶(galE)，因为其与已知的UDP-葡萄糖4-差向异构酶的氨基酸序列有较高的同源性枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、Arabidopsis thaliana、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejuni)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、黏膜炎麽拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、Pisum sativum、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、Cyamopsis tetragonoloba、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、Aquifexaeolicus、集胞蓝细菌属(Synechocystis sp.)、巴西固氮螺菌(Azospiriumbrasilense)、苜宿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、嗜热碱甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、马红球菌(Rhodococcus equi)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、海栖热袍菌(Thermotoga maritma)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、盐杆菌属(Halobacterium sp.)NRC-1、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)和唾液链球菌氏热亚种(Streptococcus thermophilus)。源自微生物如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、杜氏嗜血菌(Haemophilusducreyi)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的蛋白质也与已知UDP-葡萄糖4-差向异构酶的氨基酸序列有较高的同源性，但其功能尚未阐明。然而，尚不清楚这些蛋白是否具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶的活性及用来制备UDP-GalNAc。专利技术公开本专利技术的目的是提供生产UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的方法。本专利技术人发现因其与已知的UDP-葡萄糖4-差向异构酶的氨基酸序列有较高的同源性，但其功能尚未阐明而被认作是UDP-葡萄糖4-差向异构酶(galE)的蛋白质，或者与已知的UDP-葡萄糖4-差向异构酶的氨基酸序列具有较高同源性的蛋白质，具有UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶的活性，及发现该酶可用于UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的有效制备。本专利技术的完成基于上述发现。本专利技术涉及下列(1)至(35)。(1)制备UDP-N-乙酰半乳糖胺(以下缩写为UDP-GalNAc)的方法，其包括让酶源和UDP-N-乙酰葡糖胺(以下缩写为UDP-GlcNAc)共存于水介质中，所述的酶源为转化株的培养物，该转化株能产生具UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶(以下缩写为UDP-GlcNAc 4-差向异构酶)活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质； 让UDP-GalNAc在水介质中形成和积聚；及从水介质中回收UDP-GalNAc。(2)制备含N-乙酰半乳糖胺(以下缩写为GalNAc)的碳水化合物的方法，其包括让酶源、受体碳水化合物、GalNAC转移酶和UDP-GlcNAc共存于水介质中，所述的酶源为转化株的培养物，该转化株能产生具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质；让含GalNAc的碳水化合物在水介质中形成和积聚；及从水介质中回收含GalNAc的碳水化合物。(3)制备UDP-GalNAc的方法，其包括让酶源、尿苷-5’-三磷酸(以下缩写为UTP)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备ＵＤＰ－Ｎ－乙酰半乳糖胺（以下缩写为ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ）的方法，其包括：让酶源和ＵＤＰ－Ｎ－乙酰葡糖胺（以下缩写为ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ）共存于水介质中，所述的酶源为转化株的培养物，所述转化株产生具ＵＤＰ－Ｎ－乙酰葡糖胺４－差向 异构酶（以下缩写为ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ ４－差向异构酶）活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质；让ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ在水介质中形成和积聚；及从水介质中回收ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：远藤彻夫，小泉聪司，田畑和彦，尾崎明夫，
申请(专利权)人：协和发酵工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]