一种醛脱氢酶制造技术

本发明专利技术公开了葡糖杆菌属微生物的新醛脱氢酶，其物理化学性质是：分子量为９１，０００±５，０００；对醛类化合物有活性；被Ｃｕ↑［２＋］、Ｚｎ↑［２＋］、Ｎｉ↑［２＋］和ＥＤＴＡ所抑制；最佳ｐＨ：６．０－８．５；最佳温度２０－４０℃；刺激剂为Ｃａ↑［２＋］和ＰＱＱ。还公开了该酶的生产方法及利用该酶、该酶的生产菌或该菌的无细胞提取物从Ｌ－山梨糖醛酮生产２－酮－Ｌ－古洛糖酸的方法。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的酶，即醛脱氢酶(下称ADH)，也涉及生产这种酶的方法和利用所说的酶自L-山梨糖醛酮生产2-酮-L-古洛糖酸(下称2-KGA)的方法。2-KGA是生产维生素C的重要中间体。用微生物将L-山梨糖醛酮转变成2-KGA的反应是已知的。美国专利说明书No.3,907,639报道，蜡杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、气杆菌属、青霉属、假丝酵母属、葡糖杆菌属微生物能够促进此反应。另外，Kitamura等人(Eur.J.Appl.Microbiol，2，1，1975)报道，在生黑葡糖杆菌IFO3293中发现的氧化L-山梨糖醛酮的酶发挥酶活性不要求有辅酶或电子接受体。Makover等人(Biotechnol.Bioeng.17，1485，1975)报道了恶臭假单胞菌ATCC 21812和生黑葡糖杆菌IFO 3293颗粒部分中L-山梨糖醛酮脱氢酶活性的存在。他们也指出，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADP)不能作为该酶的辅酶。Hoshino等人(Agric.Biol.Chem.，55，665(1991))纯化并鉴定了在NAD或NADP存在下催化L-山梨糖醛酮氧化成2-KGA的酶。在本专利技术的构架中，对葡糖杆菌属的微生物进行了比较周密的研究，结果发现从所说的微生物中可以得到催化L-山梨糖醛酮氧化成2-KGA的新ADH。而且发现本专利技术提供的ADH是在诸如2，6-二氯苯酚靛酚(下称DCIP)、吩嗪甲氧基硫酸盐(下称PMS)、铁氰化物或细胞色素C之类的电子受体存在下将L-山梨糖醛酮氧化成2-KGA的，而NAD、NADP和氧不适合作电子受体。因此该ADH明显不同于已知L-山梨糖醛酮脱氢酶。本专利技术的目的之一是提供作用于L-山梨糖醛酮以生产2-KGA的新ADH，它有下列的物理化学性质a)分子量91,000±5,000(由两个均一的亚单位组成，每一亚单位的分子量为44,000±2,000)b)底物特异性对醛类化合物有活性c)抑制作用被Cu2+、Zn2+、Ni2+和乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制d)最佳pH6.0-8.5e)最佳温度20-40℃f)刺激剂Ca2+和吡咯并喹啉苯醌(下称PQQ)本专利技术的另一目的是提供生产上所限定的新ADH的方法，该方法是在有氧条件下于含水营养基中培养能够产生有上述性质的ADH的葡糖杆菌属微生物，破裂该微生物细胞，并从微生物破裂细胞的无细胞提取物中分离和纯化ADH。本专利技术的又一目的是提供利用ADH从L-山梨糖醛酮生产2-KGA的方法，该方法包括(i)在电子受体存在下用上文所限定的ADH与L-山梨糖醛酮接触，或(ii)用在有氧条件下于含水营养基中能产生上文所限定的ADH的葡糖杆菌属微生物与L-山梨糖醛酮接触，或(iii)用所说微行物的无细胞提取物与L-山梨糖醛酮接触，然后对(i)、(ii)和(iii)的每种情形，从反应混合物中分离2-KGA。按下述实施例制备的纯化的ADH样品的物理化学性质如下1)酶的活性本专利技术的新ADH在电子受体存在下催化L-山梨糖醛酮至2-KGA的氧化作用是按以下的反应式进行的L-山梨糖醛酮+电子受体→2-KGA+还原的电子受体该酶不能以氧作为电子受体，这已被确证，即用氧作为可能的电子受体去进行L-山梨糖醛酮至2-KGA的转变时，该酶没有催化活性；而且用熔解氧探测器检测，在反应混合物中检测不到氧的消耗。但是能作为电子受体的任何常规化合物都能与本专利技术的酶一起使用。DCIP、PMS、铁氰化物或细胞色素C作为电子受体是优选的。酶的分析按下述方法进行分析ADH活性的基础反应混合物由0.1mM DCIP、1.0mMPMS、50mM磷酸钾缓冲溶液(pH7.0)、2.0mM L-山梨糖醛酮、酶溶液和水组成，终体积为0.5ml，在临测定前准备。反应于25℃以L-山梨糖醛酮开始，酶活性以在600纳米处DCIP初始还原速率测定。1单位酶活性定义为每分钟催化1μM DCIP还原的酶量。pH7.0时DCIP的消光系数为14.5mM-1。参比池中含所有上述组成，但不含L-山梨糖醛酮。蛋白质浓度的测定用BCA蛋白质分析试剂(Pierce，Rockford，IL)2)底物特异性酶的底物特异性测定是用1)中所述的酶分析方法，但以各种不同的底物溶液代替L-山梨糖醛酮。已研究了纯化酶对各种底物的底物特异性(参见表1)。表1ADH的底物特异性< >得自氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)的ADH对于D，L-甘油醛和D-葡萄糖的相对活性比对于L-山梨糖醛酮的分别高约8倍和2倍。3)最佳pHADH反应速率与反应混合物的pH之间的相关性测定是用1)中所述的酶分析方法，但使用各种不同的pH和缓冲溶液(参见表2)表2ADH活性的最佳pH<tables id="table2" num="002"><table width="759">pH值相对活性(％)a)缓冲液0.1M McIlvain0.1M磷酸钾0.2M Tris-HCl4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0---69.772.6-79.0-63.9------70.093.587.190.3---------93.5-10088.778.4</table></tables>a)表中数据以pH8.0Tris-HCl缓冲液中活性的百分数表示。4)pH稳定性将酶于0℃下在各种pH的缓冲液中保持6天，然后用1)中所述的酶分析方法测定残留活性。测定结果示于表3。在pH7.5左右纯化酶是相对稳定的。5)热稳定性酶的热稳定性试验是将其置于50mM的磷酸钾缓冲溶液(pH7.5)中于各种不同的温度下保温5分钟，然后将处理后的酶立刻在冰水中冷却。用1)中所述的酶分析方法测定残留活性。酶的稳定性可达35℃，在40℃和45℃下保温后活性分别损失约50％和60％(参见表4，A栏)。表4温度对ADH稳定性和活性的影响 *未试验(A)酶稳定性试验(B)最佳温度评定试验数据以25℃时活性的百分数表示6)最佳温度测定了20℃至45℃温度范围内的酶活性。酶的最佳温度为25℃(参见表4，B栏)7)金属离子、酶抑制剂和PQQ对ADH活性的影响用1)中所述的分析方法测定活性，检验了金属离子、酶抑制剂和PQQ对ADH活性的影响。将各化合物溶液搅拌入基础反应混合物中，在加入酶时反应开始(参见表5和6)。表5各种金属对ADH活性的影响 如表5中所示，在0.04-0.2mM Ca2+存在下，酶反应被强烈刺激约3-4.5倍，而Cu2+、Fe3+、Mg2+、Mo6+、Ti4+、Zn2+和Ni2+抑制酶活性。表6酶抑制剂和PQQ对ADH活性的影响 如表6所示，EDTA强烈抑制酶活性，1.87mM的N-乙基马来酰亚胺和一碘乙酸盐分别部分抑制活性24％和13％；在氟化钠(1.87mM)、奎宁(0.95-1.87mM)、氟代乙酸钠(0.95-1.87mM)和Na2HAsO4·7H2O(1.87mM)存在下，对酶反应有5-27％的微小刺激；加入0.01mM PQQ刺激活性50％左右。8)底物浓度对反应速率的影响测定了0.15-7.54m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有下列物理化学性质的醛脱氢酶： ａ）分子量：９１，０００±５，０００ （由两个均一的亚单位组成，每一亚单位的分子量为４４，０００±２，０００） ｂ）底物特异性：对醛类化合物有活性 ｃ）抑制作用：被Ｃｕ↑［２＋］、Ｚｎ↑［２＋］、Ｎｉ↑［２＋］和ＥＤＴＡ所抑制 ｄ）最佳ｐＨ：６．０－８．５ ｅ）最佳温度：２０－４０℃ ｆ）刺激剂：Ｃａ↑［２＋］和吡咯并喹啉苯醌。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：星野达雄，杉泽辉秀，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]