一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法，所述方法将黑曲霉的GABA通路琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌株，利用重组黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的表达受Pgas启动子的调控。本发明专利技术方法实现了琥珀酸半醛脱氢酶SSD在黑曲霉中的表达，以增强GABA通路，从而加强TCA循环，促进柠檬酸的合成。

【技术实现步骤摘要】
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其是涉及一种通过重组黑曲霉菌株提高柠檬酸产量的方法。
技术介绍
柠檬酸具有广阔的应用前景和市场需求。出于经济层面考虑，一部分研究在现有菌种的基础上利用价格更低廉的粗糖原料以及农业废渣来生产柠檬酸，而另一部分研究则致力于改良菌种。生产菌种的改造和选育是柠檬酸发酵工业的基础，决定了发酵过程的成败和发酵产品工业化生产的价值。我国是柠檬酸生产大国，虽然柠檬酸转化率已经接近理论水平，产量可以达到170g·L-1，但发酵周期偏长，工业生产发酵周期普遍为72h，工业发酵水平还有待提高，现在整个行业处于非常困难的状况，而根据Alvarez-Vasquez的模型，黑曲霉的柠檬酸生产仍然有巨大的提高空间，所以几十年来黑曲霉柠檬酸生产菌种的改良一直是关注的焦点。目前，黑曲霉的柠檬酸工业生产菌株均通过诱变获得，大量研究依然集中于对工业生产菌株利用甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、Co-射线、紫外线等进行单一或复合诱变来选育更高产的菌株。近年来，黑曲霉基因组测序数据被公布，可以构建黑曲霉全面的代谢网络，利用代谢工程改造黑曲霉可以有目的地修饰细胞代谢途径，减少诱变育种筛选所面临的庞大工作量。基于现有转录组学数据，发现GABA通路对柠檬酸合成有巨大影响，一方面补充TCA循环所需的琥珀酸，另一方面提高细胞耐酸性，通过代谢改造加强GABA通路有望进一步提升柠檬酸产量。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法。本专利技术方法实现了琥珀酸半醛脱氢酶SSD在黑曲霉中的表达，以增强GABA通路，从而加强TCA循环，促进柠檬酸的合成。本专利技术的技术方案如下：一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法，其特征在于所述方法将黑曲霉的GABA通路琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌株，利用重组黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的表达受Pgas启动子的调控。所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示的序列上发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入而得到的序列。所述Pgas启动子为低pH诱导型启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。一种琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因表达框，所述表达框包括Pgas启动子、琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因和trp终止子，按照Pgas-SSD-trp的顺序排布。所述Pgas启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述trp终止子的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。所述重组黑曲霉菌株的构建方法为：(1)构建琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因表达框Pgas-SSD-trp；(2)构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp；(3)将步骤(1)和步骤(2)制得的基因表达框转化到黑曲霉基因中，经抗性筛选和PCR鉴定获得所述重组黑曲霉菌。所述抗性基因表达框gpdA-hph-trp中gpdA为启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。所述抗性基因表达框gpdA-hph-trp中hph基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术利用低pH诱导型启动子启动SSD蛋白在黑曲霉中表达，通过增强GABA通路，从而提高柠檬酸的产量。本专利技术方法，利用AspergillusnigerH915-1作为宿主，柠檬酸产量提高了10％；在42℃下发酵，产量提高45.2％，时间缩短10h；利用更偏酸的初始培养基，产量提高6.4％。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术进行具体描述。实施例(1)黑曲霉RNA的提取：将黑曲霉孢子接种到柠檬酸发酵培养基中，35℃250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司RNeasyPlantMiniKit提取黑曲霉总RNA，用TAKARA公司PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser将RNA反转录成cDNA；(2)黑曲霉基因组DNA的提取：将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基(3％麦芽提取物，0.5％胰蛋白胨)中，35℃250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasyPlantMiniKit提取丝状真菌基因组；(3)SSD蛋白表达框的构建：①利用引物trp-F(序列如SEQIDNO.7所示)和trp-R(序列如SEQIDNO.8所示)以pAN7-1为模板扩增trp终止子(序列如SEQIDNO.6)，序列上下游含PstI和HindIII位点，连接到pMD19上测序，用这两个限制性内切酶酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19上，得到pUC19-trp；②利用引物Pgas-F(序列如SEQIDNO.9所示)和Pgas-R(序列如SEQIDNO.10所示)从黑曲霉基因组中扩增Pgas启动子(序列如SEQIDNO.3)，序列两头含EcoRI和KpnI酶切位点，酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19-trp，得到pUC-Pgas-trp；③利用引物gas-SSD-F(序列如SEQIDNO.11所示)以及Trp-SSD-R(序列如SEQIDNO.12所示)进行RT-PCR扩增得到SSDCDS的基因序列(序列如SEQIDNO.1，其氨基酸序列为SEQIDNO.2)，序列两端分别含有pUC-Pgas-trp约20bp同源序列，利用VazymeOneStepCloneKit进行同源重组，形成gas-SSD-trp表达框，得到pGSH表达载体；用到的引物如下：trp-F：ctgcagGATCCACTTAAACGTTACTGAAATCtrp-R：aagcttCTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGPgas-F：gaattcCTGCTCTCTCTCTGCTCTCTTTCTPgas-R：ggtaccGTGAGGAGGTGAACGAAAGAAGACGas-SSD-F：gttcacctcctcacGGTACCATGGGTTACACTGTCCCTCCGCTrp-SSD-R：TAACGTTTAAGTGGATCGGATCCCTACTGAAGAGGCTCAATTCC(4)黑曲霉原生质体的制备和转化：①按3×105/ml的浓度接种黑曲霉孢子至PDA液体培养基，30℃、200r/min培养过夜，用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球；②称取0.5g/L的lysingenzyme，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌，称取0.5g菌球，加入到酶解液中，37℃、100r/min震荡培养约3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μLSTC，混匀，制得黑曲霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法，其特征在于所述方法将黑曲霉的GABA通路琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌株，利用重组黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的表达受Pgas启动子的调控。

【技术特征摘要】
1.一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法，其特征在于所述方法将黑曲霉的GABA通路琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌株，利用重组黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的表达受Pgas启动子的调控。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示的序列上发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入而得到的序列。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述Pgas启动子为低pH诱导型启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。5.一种琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因表达框，其特征在于所述表达框包括Pgas启动子、琥珀酸半醛脱氢酶SSD基因和trp终止子，按...

【专利技术属性】
技术研发人员：金赛，胡志杰，彭艳红，蒋小东，孙福新，苗茂栋，周东姣，李江华，刘龙，
申请(专利权)人：江苏国信协联能源有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32