一种利用微生物发酵生产α、ω-长链二元酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用微生物氧化Ｃ↓［１０］－Ｃ↓［１８］正烷烃生产α，ω－长链二元酸的方法，特别是高产Ｃ↓［１２］－Ｃ↓［１５］单一二元酸的方法。利用一株难以利用正烷烃作生长碳源的热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｓ）突变株ＰＦ－ＵＶ－５６，发酵生产α，ω－长链二元酸。以Ｃ↓［１３］和Ｃ↓［１５］正烷烃分别作转化基质发酵，总培养时间１３８小时，气相色谱法分析发酵清液中ＤＣＡ１３和ＤＣＡ１５分别为１５８ｇ／Ｌ和１６２ｇ／Ｌ；以Ｃ↓［１２］和Ｃ↓［１４］正烷烃分别作转化基质发酵，总培养时间１２０小时，气相色谱分析发酵清液中ＤＣＡ１２和ＤＣＡ１４分别为１５３ｇ／Ｌ和１４８ｇ／Ｌ。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用微生物发酵从正烷烃生产α，ω-长链二元酸的方法，特别是生产C12～C15长链二元酸的方法。长链二元酸是难以用化学合成法生产的精细化工原料，它们被广泛地应用于香料、热熔胶、工程塑料、增塑剂和液晶等材料的合成。从七十年代起，利用微生物发酵从C10～C18正烷烃生产长链二元酸开始进入试验室应用研究阶段，经过10多年的研究，到85年日本率先建立年产200吨的工业化生产装置。十三碳二元酸(DCA13)是合成麝香-T(Musk-T)、高档服装用热熔胶等的重要原料；十二碳二元酸(DCA12)主要用于合成特性高级工程塑料，如尼龙12和尼龙1212。在长链二元酸中上述两种二元酸用途最广，市场用途最大，其社会效益和经济效益最为显著。在公开的专利中，具有实际应用价值的文献是US4339536、CN1130685A、CN1162644A以及CN1092108A、CN1017350B和CN1026129C，其中，后三种专利文献分别公开了利用可同化正烷烃作生长碳源的热带假丝酵母氧化正烷烃生产长链二元酸的方法，但是这三篇专利只是分别对应十五碳二元酸、十六碳二元酸和十七碳二元酸效果较好，每篇专利的实例中只有以上所对应的烷烃转化二元酸数据。对应这三种专利的实例中结果分别为在2.5M3发酵罐中发酵144小时，乙醚萃取NaOH标准溶液滴定分析发酵清液中DCA15为178g/L；在10升发酵罐中，发酵117小时，气相色谱分析DCA16为123.4g/L，转化率79％；发酵140小时，乙醚萃取NaOH标准溶液滴定分析发酵液中DCA17为133g/L，转化率61.8％；US4339536所提出微生物发酵生产长链二元酸的方法，也是利用可同化正烷烃的热带假丝酵母(Candida tropicalis)在含有正烷烃的培养基中，在pH 3～5条件下培养6～24小时，然后调节pH 6.5～7.5开始产酸.发酵结束后，将发酵液pH调至10～13，加2～8％硅藻土混合在6～8Kg/cm2压力下过滤，用2～3倍水洗涤，将洗涤水和滤液混合，用H2SO4酸化至pH4以下，加热70～80℃维持8小时。经过滤、洗涤和干燥得到二元酸产品。在实施例三中，将120L种子液接种至1200L发酵培养基中，发酵84小时，DCA13为45g/L，在实施例四中DCA12为42g/L。CN116244A公开了生产十三碳二元酸的方法。①利用一株可同化正烷烃的热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株P-12-242，用烷烃种子培养基培养种子；②将种子液接入含有正烷烃的发酵培养基中，28小时内pH控制6.8以下，以菌体生长为主，并产一定数量的二元酸；28～60小时，pH控制在7.3以上，以产酸为主。增加一定量菌体，60小时后pH控制7.5～7.8，再积累二元酸。在2.5M3发酵罐内发酵161小时，发酵清液中DCA13最高达205g/L(乙醚萃取NaOH标准液滴定分析)，转化率达94％；③发酵结束后，调pH10～12，加热85～90℃，破乳分层，将清液层和分离菌体后的清液合并，加入活性炭，在85～90℃脱色30min，过滤后，加热脱色液至60～70℃，酸化pH 4～5，冷却至70℃，压滤干燥，其DCA13纯度达96～97％。CN1130685A公开了一种生产长链二元酸的方法，对十二碳二元酸的效果较好，实例中也只有关于十二碳二元酸的数据。①利用一株可同化正烷烃的热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株UH-2-48，用烷烃培养基培养种子；②将种子液接入发酵液培养基中，以正烷烃为生长碳源培养菌体约40～48小时。然后调pH至7.0～7.8以产酸为主，在3M3发酵罐中发酵130小时，DCA12为145g/L(分析方法同CN116244A)，转化率为90％，最终产品纯度达97.1％。上述专利文献中，虽然US4339536生产DCA12和DCA13产量相当，但最高仅为45g/L，而其它专利文献所公开的生产长链二元酸的方法，只是对某一种二元酸而言产量较高，对其它长链二元酸来说其效果欠佳，并且以上所述的各种方法中都是利用可同化烷烃作生长碳源的微生物进行发酵，无论是种子培养还是发酵用菌体的培养都是利用烷烃作生长碳源，必然要消耗部分烷烃用于细胞合成，从而降低了烷烃对二元酸的转化率。本专利技术的目的是提出一种利用难以同化烷烃作生长碳源的微生物发酵生产长链二元酸的方法，从C10～C18正烷烃中经发酵生产相应碳数的长链二元酸或混合二元酸，特别是针对C12～C15长链二元酸，产酸量和转化率均较高。本专利技术所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株PF-UV-56，该突变株保藏正在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为中国.北京.中关村)，保藏日期为98年8月31日，保藏编号为CGMCC №0356。它是一株难以在正烷烃作生长碳源上生长及不能在长链二元酸作生长碳源上生长的突变株。以糖质(如蔗糖、葡萄糖、纤维二糖、半乳糖中的一种或几种)等在生长期作生长碳源迅速增殖细胞，生长期仅为12～20小时；在产酸期以C1～C3一元酸盐或C1～C3一元醇作二次生长碳源维持菌体一定比生长速率和较高的产酸速率，提高产酸量和烷烃转化率。Candida tropicals PF-UV-56突变株生理特性如下一、形态特征斜面菌呈缎丝状；液体培养大部分为单一细胞，呈卵圆形。两端芽殖，不产子囊胞子，有膜；菌落也不规则，有皱摺，呈梅花状。二、生理特性不同化硝酸盐，难以同化正烷烃作生长碳源，能同化葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、半乳糖，能同化C1～C3一元酸盐和C1～C3一元醇；不能同化棉子糖、乳糖、鼠李糖；能发酵蔗糖、麦芽糖、半乳糖和葡萄糖，不同化肌醇、赤藓糖。在39℃微弱生长，牛奶反应阴性。本专利技术的种子培养基可以为(1)斜面培养基10Brix麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；(2)液体种子培养基蔗糖10～40g/L，金属磷酸盐2～10g/L，酵母膏1～3g/L，玉米浆1～3g/L，尿素1～4g/L，NaCl 0.5～1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～3g/L，维生素B120～200ppm，正烷烃0～50ml/L，自来水配制，自然pH。正烷烃可以是C10～C18正烷烃，较好是C12～C15烷烃。本专利技术的发酵培养基为蔗糖20～40g/L，金属磷酸盐2～10g/L，酵母膏0.5～2g/L，玉米浆0.5～2g/L，尿素1～2g/L(分消)，NaCl 0.5～2.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，维生素B120～200ppm，铵盐2～8g/L(分消)，C1～C3一元酸盐或一元醇5～15g/L，正烷烃50～350ml/L，自来水配制，自然pH。金属磷酸盐可以是钾盐或钠盐；C1～C3一元酸盐可以是甲酸、乙酸或丙酸的钠盐或钾盐，一元醇指的是甲醇、乙醇和丙醇，它们适宜在糖质接近消耗殆尽进入产酸期前加入，也可以直接加入最初配制的培养基中；铵盐可以是(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4或CH3COONH4；正烷烃可以是C10～C18烷烃，特别是C12～C15正烷烃；在种子培养基中加入烷烃和发酵培养基在生长期加入烷烃的目的是起诱导合成长链二元酸相关酶作用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用微生物发酵生产α，ω－长链二元酸的方法，包括：用热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｓ）突变株ＰＦ－ＵＶ－５６，即ＣＧＭＣＣ №０３５６在包括糖质的多元底物作生长碳源的液体培养基中发酵，氧化Ｃ↓［１０］～Ｃ↓［１８］正烷烃，积累相应碳数的二元酸，并从发酵液中回收所积累的二元酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘树臣，李淑兰，方向晨，佟明友，
申请(专利权)人：中国石油化工集团公司，中国石油化工总公司抚顺石油化工研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]