异源蛋白的生产方法技术

一种异源蛋白的生产方法，包括在含有脂肪酸或其盐和表面活性剂的培养基上培养经基因操作制得的产异源蛋白宿主，且从培养物中收集异源蛋白。产异源蛋白宿主产生异源蛋白的量可以增加，此外，由于宿主本身分泌的酶对异源蛋白的降解可以被抑制，由此可以大幅度增加产生的异源蛋白的量。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种异源蛋白生产方法的改进，其中包括经基因操作转化的宿主的培养。
技术介绍
大量的蛋白被用作药剂，例如人血清白蛋白(以下称为HSA)，其是血浆的一种主要蛋白成分，这样的一些蛋白可通过体液的分级来产生，此种方法在原料方面会遇到一些困难，并且生产的制剂有很大的可能性被病毒等污染。近年来重组DNA技术的兴起，使得利用微生物和细胞来生产这些蛋白成为可能，促进了通过基因操作来进行异源蛋白大规模生产的发展和研究。然而，其产量仍旧很低且还没有能够得到大规模的生产。提高异源蛋白产量的方法包括向培养基中加入脂肪酸或其盐以增加重组HSA产量的方法(以下称为rHSA)(JP-A-4293495)，一种包括加入含有聚亚烷基二醇基团的高浓度表面活性剂的方法(日本专利申请公开号平成3-500969)等等。考虑到如此的技术背景，本专利技术目的在于通过特定地改进培养条件来增加异源蛋白的产量。
技术实现思路
专利技术人为了解决上述问题进行了深入的研究，发现通过在含有脂肪酸或其盐和表面活性剂的培养基上培养经基因操作制得的产异源蛋白宿主能够提高异源蛋白的产量，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术提供了如下所述的。(1).一种，包括在含有脂肪酸或其盐和表面活性剂的培养基上培养经基因操作制得的产异源蛋白宿主，且从培养物中收集异源蛋白。(2).如(1)所述的生产方法，其中的脂肪酸有10-26个碳原子。(3).如(1)所述的生产方法，其中的培养基含有一种浓度为0.01-10W/V％脂肪酸或其盐。(4).如(1)所述的生产方法，其中的表面活性剂是分子量为100-100000的非离子表面活性剂。(5).如(1)所述的生产方法，其中的培养基含有浓度至多0.5g/L的表面活性剂。专利技术的详述在本专利技术中，异源蛋白是指外来的蛋白，其不仅指宿主细胞非固有的而且指经转化产生的。现在将一种公开于已知的出版物上的异源蛋白生产宿主改进，经基因操作用于本专利技术，其可以不受限制只要通过基因操作改造能产生异源蛋白。其特定的实施例其包括细胞(例如大肠杆菌，酵母，枯草芽孢杆菌等)，动物细胞等，其经基因改造以产生一种异源蛋白。特定地，在本专利技术中。宿主优选为酵母，其可为糖酵母属或毕赤酵母属，这些宿主的营养缺陷型或抗生素敏感型也可以被使用。可选择地，啤酒糖酵母(Saccharomyce cervisiae)AH22菌株其是G418敏感型菌株(a，his4，leu2，can1)，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GTS115菌株(his4 NRRL保藏号No.Y-15851，)等可被使用。产异源蛋白宿主产生的异源蛋白是不特定限定的且优选的实施例为HSA。这些产异源蛋白宿主可通过已知方法或其类似的方法来制备。例如，一种产HSA宿主(或产HSA菌株)可以通过下述方法来制备，一种使用已知的HSA基因的方法，(JP-A-58-56684，JP-A-58-90515，JP-A-58-150517)，一种使用新HSA基因的方法(JP-A-62-29985，JP-A-1-98486)，一种使用一段合成信号序列(JP-A-1-240191)的方法，一种使用血清白蛋白信号序列的方法(JP-A-2-167095)，一种含有重组质粒整合在染色体上的方法(JP-A-3-72889)，一种含有宿主的融合的方法(JP-A-3-53877)，一种包括在含有甲醇的培养基上突变的方法，一种利用突变子AOX2启动子的方法(JP-A-6-90768，JP-A-4-299984)，HSA通过枯草芽孢杆菌的表达(JP-A-62-25133)，HSA通过酵母的表达(JP-A-60-41487，JP-A-63-39576，JP-A-63-74493)，HSA通过毕赤酵母的表达(JP-A-2-104290)等等。其中，在含有甲醇的培养基上进行诱变的方法如下所述，一个带有在AOX1启动子控制下表达HSA的转录单元的质粒被导入一个合适的宿主的AOX1基因区域，宿主优选为毕赤酵母，特别的是巴斯德毕赤酵母GTS115菌株通过常规方法以提供转化子(JP-A-2-104290)。此转化子在含有甲醇的培养基中有很弱的增殖能力。因此，通过公开于JP-A-4-299984中的方法，此转化子被培养在含有甲醇的培养基上以引起诱变并且只有能够生长的菌株被恢复。在这种情况下，甲醇的浓度大约为0.0001％-5％。培养基可以是合成的或天然的。培养条件是15℃-40℃，大约是1小时-1000小时。只要用于培养转化的宿主的培养基含有一种脂肪酸或其盐，并且含有一种表面活性剂，则对与其他组分可以无其他限制，且本领域公知培养基经常被应用。在含有脂肪酸或其盐和表面活性剂的培养基上培养被转化的宿主能够增加异源蛋白的产量。此外，宿主本身分泌的酶能抑制异源蛋白的分解。优选的脂肪酸的实施例包括10到26个碳原子。上述脂肪酸的实施例包括饱和的和不饱和例如十四烷酸，棕榈酸，棕榈烯酸，油酸，叔-异油酸，亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸等。这些脂肪酸的盐是，例如碱金属盐如钠盐，钾盐，钙盐等，碱土金属盐以及有机铵盐，作为参考被加入到含有油酸或其盐的培养基中。培养基中脂肪酸的含量大约为0.01-10W/V％，优选的为大约0.2-5W/V％。本专利技术中所用的表面活性剂是非离子表面活性剂优选的为有100-100000的高分子量。上述的非离子表面活性剂的实施例包括聚亚烷基二醇(例如有平均分子量为1000-10000优选为2000-60000的聚丙二醇)，聚氧化亚烷基共聚物(例如平均分子量为100-100000优选为1000-30000的聚氧化亚乙基-聚氧化亚丙基共聚物)，氢化蓖麻油聚氧化亚烷基衍生物，蓖麻油聚氧化亚乙基(20)醚，蓖麻油聚氧化亚乙基(40)醚，蓖麻油聚氧化亚乙基(100)醚等]，聚氧化亚乙基脱水山梨醇脂肪酸脂(例如聚氧化亚乙基脱水山梨醇一油酸脂，聚氧化亚乙基脱水山梨醇一硬脂酸酯，聚氧化亚乙基脱水山梨醇一棕榈酸酯，聚氧化亚乙基脱水山梨醇一月桂酸酯等)，脱水山梨糖醇脂肪酸脂，烷基苯酚聚氧化亚乙基醚，聚氧化亚乙基脱水山梨醇脂肪酸脂，聚氧化亚乙基氢化蓖麻油，聚甘油脂肪酸脂等。特别地，优选的培养基含有聚亚烷基二醇聚氧化亚乙基聚氧化亚丙基共聚物(Pluronic商标等)，或聚氧化亚乙基脱水山梨醇脂肪酸脂(Tween商标等)。培养基中表面活性剂的含量优选的至多为0.5g/L。培养基可以是合成的培养基或天然的培养基，优选为合成的培养基，培养基可以是固体的培养基或液体的培养基，优选为液体的培养基。例如，合成的培养基一般含有不同的糖作为碳源，尿素、铵盐、硝酸盐等作为氮源，不同的维生素、核苷酸等作为痕量的营养素以及含有无机盐(例如Mg，Ca，Fe，Na，K，Mn，Co，Cu等)。培养基的实施例包括YNB液体培养基等。天然培养基的实施例包括YPD液体培养基。当使用利用甲醇的宿主时，含有甲醇的培养基可被利用。这种情况下，甲醇的浓度优选为约0.01-5％。本专利技术的培养基通过将脂肪酸或其盐和表面活性剂加至传统的已知培养基中可以很容易的来制备。其他的培养条件类似于那些传统方法所利用的培养条件。培养温度是，例如，15℃-40℃，一般为20℃-37℃。当宿主为酵母时，优选为20℃-30℃，当宿主为细菌时，优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异源蛋白的生产方法，包括在含有脂肪酸或其盐和表面活性剂的培养基上培养经基因操作制得的产异源蛋白宿主，且从培养物中收集异源蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：应田丰雄，大屋智资，桑江忍，大山政男，小林薰，上村八寻，
申请(专利权)人：三菱制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]