一株基因工程菌乳酸乳球菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基因工程菌乳酸乳球菌及其应用，该基因工程菌乳酸乳球菌

A gene engineered strain of Lactococcus Lactococcus and its application

The invention discloses a gene engineered strain of Lactococcus Lactococcus and its application, which is a genetically engineered strain of Lactococcus Lactococcus

【技术实现步骤摘要】
一株基因工程菌乳酸乳球菌及其应用
本专利技术涉及一种基因工程菌乳酸乳球菌及其应用，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
对羟基苯乳酸（OH-PLA），又称3-（4-羟基苯基）乳酸，是一种广泛存在自然界中的小分子天然有机酸；可以抑制多种病原菌的生长，被认为是一种新型生物防腐剂。OH-PLA稳定性好，熔点为106~110℃，亲水性比较大，能在食品体系中均匀扩散，在食品防腐领域显现巨大潜力。对羟基苯乳酸广泛存在于各种传统发酵食品中，是传统发酵食品优势菌群---乳酸菌的一种主要代谢产物。乳酸菌是公认的食品级安全微生物，因其可以定居于人类肠道且有益于人体健康，经常作为益生菌应用于食品、保健品和药品等领域。从分类学上看，乳酸菌包含43个属，约373个种和亚种。植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）和乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）是乳酸菌两个常见种。目前OH-PLA的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。在微生物发酵法中，改变优化发酵底物和发酵条件以提高OH-PLA产量是研究的主流，而通过基因工程手段改变OH-PLA生物合成路径的研究只有一例。Koma等人（2012）通过在大肠杆菌（Escherichiacoli）中导入乳酸脱氢酶基因，使发酵上清中的OH-PLA含量显著增加。本专利技术利用基因工程手段，从植物乳杆菌L8（分离于豆豉---一种中国传统发酵食品）中克隆预苯酸脱氢酶基因（pdh），将该基因连接到表达质粒pNZ8048上，再转化至乳酸乳球菌NZ9000中，得到重组表达菌株NZ9000/pNZ8048-pdh，该基因工程菌经乳酸链球菌素（nisin）诱导，使pdh在乳酸乳球菌中高效表达，可提高OH-PLA产量，加强对食源性病原菌抑制性。因pdh来源和异源表达菌株均是食品级微生物以及OH-PLA自然存在于各种传统发酵食品中，所以本专利技术获得的OH-PLA是一种天然的、安全无毒的新型食品防腐剂，在食品防腐领域具有广阔的应用前景。经文献检索，未见与本专利技术相同的公开文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因工程菌乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000/pNZ8048-pdh，该基因工程菌已于2017年8月28日保藏在中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号为CCTCCNO：M2017453。本专利技术利用PCR技术从食源性乳酸菌中扩增预苯酸脱氢酶基因（pdh），该基因与表达载体pNZ8048连接后，将得到的重组表达载体pNZ8048-pdh转入乳酸乳球菌NZ9000细胞内中，通过氯霉素抗性筛选获得pdh异源表达基因工程菌NZ9000/pNZ8048-pdh。本专利技术基因工程菌乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000/pNZ8048-pdh的构建，步骤如下：（1）pdhPCR扩增：以植物乳杆菌L8基因组DNA为模板，利用引物（pdh-F：5’-AGCCCATGGTGACAACTGTATTGATCAAAG-3’，下划线为NcoI酶切位点；pdh-R：5’-TCCAAGCTTTTAATGATGATGATGATGATGATTCCTCCTTACAATCTGATA-3’下划线为HindⅢ酶切位点，斜体表示6个His）扩增pdh基因；（2）表达载体构建：将PCR产物和表达质粒pNZ8048分别用NcoI和HindⅢ双酶切，回收后，将pdh和pNZ8048以5:1～2:1的摩尔比例，用T4连接酶在16℃连接16h；连接产物经热激转化法导入大肠杆菌DH5α感受态细胞后，在含有25µg/mL氯霉素的LB固体培养基37℃培养16h，筛选转化子；利用PCR验证转化子，提取阳性转化子质粒，测序确定序列正确性，获得表达载体pNZ8048-pdh；（3）乳酸乳球菌转化：在10kv/cm，200Ω的电转条件下，将上述表达载体导入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中，用含10µg/mL氯霉素的GM17固体培养基筛选阳性转化子，获得基因工程菌NZ9000/pNZ8048-pdh。在上述基因工程菌中，所述预苯酸脱氢酶的核苷酸如序列表序列1（SEQIDNO:1）所示。本专利技术另一目的是将基因工程菌乳酸乳球菌应用在表达重组预苯酸脱氢酶（PDH）中。本专利技术构建的基因工程菌乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-pdh在生产OH-PLA中的应用，步骤如下：（1）乳酸链球菌素诱导pdh基因表达：在乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-pdh的OD600为1.0的GM17培养基中，分别加入终浓度为0、10和20ng/mL的乳酸链球菌素，30℃诱导3h后，离心收集菌体，用20mLPBS重悬菌体；重悬液用超声波破碎后离心，上清用SDS-PAGE和Westblotting杂交检测PDH蛋白表达；（2）OH-PLA含量测定：在乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-pdhOD600为1.0的GM17培养基中，同时加入乳酸链球菌素（终浓度为0或20ng/mL）和PDH直接作用底物（预苯酸钡盐，0、0.1、0.25或0.5mg/mL），30℃诱导反应15min后，离心收集上清，0.45µm滤膜过滤，滤液用高效液相色谱法（HPLC）分析。结果显示，乳酸链球菌素诱导下的OH-PLA产量显著高于不诱导；加预苯酸钡盐时OH-PLA的产量高于不加底物。本专利技术基因工程菌乳酸乳球菌经乳酸链球菌素（nisin）诱导发酵后应用在抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、扩展青霉（Penicilliumexpansum）中。本专利技术所述基因工程菌NZ9000/pNZ8048-pdh在抑制食源性病原菌中的应用，步骤如下：（1）发酵上清液制备：在乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-pdh的OD600为1.0的GM17培养基中，加入终浓度为0或20ng/mL乳酸链球菌素或同时加入乳酸链球菌素（终浓度为20ng/mL）和预苯酸钡盐（终浓度为0.1mg/mL），30℃诱导反应15min后，离心收集上清，0.45µm滤膜过滤，滤液即为食源性病原菌抑制用上清液；（2）NZ9000/pNZ8048-pdh对食源性病原细菌的抑制：在一次性96孔微量稀释盘Costar3375（CorningIncorporated，USA）的每一个孔中，分别加入75μL上述发酵上清液和1.5μL1.0×107cfu/mL金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）或单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）以及23.5μLBHI培养基，37℃培养箱中静置培养16h，用酶标仪读取OD600值。结果显示，NZ9000/pNZ8048-pdh发酵上清液对金黄色葡萄球菌的抑制率为36%（培养物中仅加入乳酸链球菌素）和39%（同时加入乳酸链球菌素和预苯酸钡盐），对单核细胞增生李斯特菌的抑制率为31%（培养物中仅加入乳酸链球菌素）和51%（同时加入乳酸链球菌素和预苯酸钡盐）。（3）NZ9000/pNZ8048-pdh对食源性病原真菌的抑制：在一次性96孔微量稀释盘Co本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株基因工程菌乳酸乳球菌

【技术特征摘要】
1.一株基因工程菌乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000/pNZ8048-pdh，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2017453。2.权利要求1所述的基因工程菌乳酸乳球菌在表达重组预苯酸脱氢酶中的应用。3.权利要求1所述的基因工程菌乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗义勇，张柯，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53