木白斯他汀、其制备方法以及作为药物的应用技术

本发明专利技术涉及通过培养微生物ＨＩＬ－００８００３（ＤＳＭ１１６４１）获得的称为木白斯他汀（Ｍｕｍｂａｉｓｔａｔｉｎ）的化合物，及其可药用盐和衍生物。木白斯他汀是葡萄糖－６－磷酸移位酶抑制剂，并可用于治疗糖尿病。本发明专利技术还涉及制备木白斯他汀的方法，微生物ＨＩＬ－００８００３（ＤＳＭ１１６４１），木白斯他汀及其可药用盐和衍生物作为药物的应用、尤其是在治疗糖尿病中的应用，以及包含木白斯他汀或其可药用盐或衍生物的药物组合物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过培养微生物HIL-008003(DSM 11641)获得的称为木白斯他汀(Mumbaistatin)的化合物，及其可药用盐和衍生物。木白斯他汀是葡萄糖-6-磷酸移位酶抑制剂，并可用于治疗糖尿病。本专利技术还涉及制备木白斯他汀的方法，微生物HIL-008003(DSM 11641)，木白斯他汀及其可药用盐和衍生物作为药物的应用、尤其是在治疗糖尿病中的应用，以及包含木白斯他汀或其可药用盐或衍生物的药物组合物。肝脏葡萄糖输出速率增加是糖尿病的一般特征。特别是对于非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，在禁食血浆葡萄糖水平和肝脏葡萄糖输出之间有很强的关联。在肝脏中生成葡萄糖的2个途径是糖异生和糖原分解。这两个途径的最终步骤都是由微粒体葡萄糖-6-磷酸酶-一种血液葡萄糖水平内环境稳定性调节中的关键酶-催化的。已知在实验性和病理性糖尿病中该酶的水平也有增加。因此，干扰该酶系统应当能减少肝脏葡萄糖的生成。肝脏葡萄糖-6-磷酸酶是多组分系统，其包括至少3个机能活性葡萄糖-6-磷酸移位酶(T1)、葡萄糖-6-磷酸磷酸水解酶和磷酸/焦磷酸移位酶(T2)。葡萄糖-6-磷酸移位酶促进葡萄糖-6-磷酸转运到内质网(ER)的腔中。活性位点位于ER腔表面的磷酸水解酶将葡萄糖-6-磷酸水解，并将葡萄糖和磷酸释放到腔中。虽然磷酸/焦磷酸移位酶促进磷酸的流出，但是葡萄糖流出的确切机制仍然不清楚。葡萄糖-6-磷酸移位酶的高度底物特异性使得其成为糖尿病治疗中药物干预的潜在目标。因此，在生理生成的糖磷酸酯当中，只有葡萄糖-6-磷酸是由该移位酶转运的。与之相反，磷酸酶是非特异性的，并且已知能水解多种有机磷酸酯。文献中已经描述了葡萄糖-6-磷酸酶的一系列非特异性抑制剂，例如根皮苷(《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)242,1955-1960(1967))、5,5′-二硫代双-2-硝基苯甲酸(《生物化学与生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)48,694-699(1972))、2,2′-二异硫氰酸根合茋和2-异氰硫基-2′-乙酰氧基茋(《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)255,1113-1119(1980))。欧洲专利申请EP-A-587087和EP-A-587088中提出了最早的可用于治疗的葡萄糖-6-磷酸酶系统抑制剂。在国际专利申请PCT/EP 98/02247中描述的柯达斯他汀(Kodaistatins)A、B、C和D是最早的得自微生物源的葡萄糖-6-磷酸移位酶抑制剂。现在已经发现，从不同微生物源可获得具有高葡萄糖-6-磷酸移位酶抑制活性的称为木白斯他汀的新化合物。因此本专利技术涉及称为木白斯他汀的化合物，其分子式为C28H20O12，其特征在于下述任意一个或多个其物理化学和光谱特征，例如在附图9的1H NMR光谱中描述的其1H NMR光谱数据，在附附图说明图10的13C NMR光谱中描述的其13C NMR光谱数据，本专利技术还涉及该化合物的可药用盐和衍生物，例如酯、醚和明显的化学同等物，包括所有立体异构形式和互变异构形式。木白斯他汀具有迄今为止未报道过的新结构，属于醌类化合物。采用木白斯他汀的分子式作为检索关键词进行的化学文摘文献检索表明木白斯他汀是新化合物。没有任何其它化合物代表木白斯他汀的结构特征。木白斯他汀是通过培养称为HIL-008003或Y-9645974(下文中称为HIL-008003)的微生物而获得的。用于制备木白斯他汀的微生物是从采集自Amboli,Maharashtra,India附近的Hiranyakeshi河床的土壤样本分离到的。微生物HIL-008003已被鉴定为石蕊杀菌素链霉菌(Streptomyces litmocidini)。德国微生物和细胞培养物收藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),Mascheroder Weg 1b,D-38124,Braunschweig,Germany已经于1997年7月4日保存了该微生物，并且给出登记号DSM 11641。因此，本专利技术还提供了由链霉菌HIL-008003、其突变株和变体制备称为木白斯他汀的新化合物及其可药用盐和衍生物的方法。所述方法包括在含有一种或多种碳源和一种或多种氮源以及任选含有的营养无机盐和/或微量元素的营养培养基中于需氧条件下培养HIL-008003、其突变株或变体，然后分离所述化合物，并按照常规方式纯化。营养培养基优选含有碳源、氮源和营养无机盐以及任选含有的微量元素。碳源是例如淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、果糖、糖蜜、甘油、乳糖或半乳糖，优选为葡萄糖。氮源是例如大豆粉、花生粉、酵母提取物、牛肉提取物、胨、胰胨、麦芽提取物、玉米浆、明胶或酪蛋白氨基酸，优选为大豆粉和玉米浆。营养无机盐和微量元素是例如磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钴、氯化钙、碳酸钙、硝酸钾、硫酸铵或硫酸镁，优选为氯化钴和碳酸钙。HIL-008003的培养通常在25-30℃和pH 6.0-8.0进行。优选在27℃(±1℃)和pH 7.0培养HIL-008003。为了以最佳产率获得本专利技术木白斯他汀，HIL-008003的发酵优选进行约40-70小时。特别优选在浸没条件下例如浸在摇瓶以及实验室用发酵罐中发酵约40-48小时。如果需要的话，可在发酵罐中使用Desmophen(聚环氧丙烷)作为防沫剂。可通过下述方法检测发酵进程和木白斯他汀的形成按照在《酶学方法》(Methods in Enzymology)174,58-67(1989)描述的方法、进行一些改进，采用比色分析于室温下在微量滴定板中在未处理和用Triton X-100破裂的大鼠肝脏微粒体中测定对葡萄糖-6-磷酸移位酶活性的抑制。在所得肉汤培养物中，木白斯他汀主要存在于培养物滤液中，因此可这样回收木白斯他汀通过在pH 5-8用不混溶于水的溶剂例如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和丁醇萃取该培养物滤液进行回收，或者通过使用Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Industries Limited,Japan)、Amberlite XAD(Rohm and Haas Industries,U.S.A.)、或活性炭的疏水作用色谱法进行回收，或者在pH 5-8通过离子交换色谱法进行回收。优选的方法是，用Diaion HP-20吸附，然后用洗脱剂例如水、甲醇、丙酮、乙腈、正丙醇、异丙醇或它们的混合物将该化合物解吸。将该活性洗脱液浓缩和冷冻干燥，获得了粗产物。可使用任一下述技术将所得粗产物进一步纯化正相色谱法，使用氧化铝或硅胶作为固定相，洗脱剂是例如乙酸乙酯、氯仿、甲醇或它们的混合物；反相色谱法，使用反相硅胶例如称为RP-18的二甲基十八烷基甲硅烷基硅胶、或称为RP-8的二甲基辛基甲硅烷基硅胶作为固定相，洗脱剂是例如水，缓冲液例如磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液(pH 2-8)，和有机溶剂例如甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃或这些本文档来自技高网...

【技术保护点】
以所有立体异构体和互变异构体形式存在的化合物木白斯他汀及其可药用盐和衍生物，该化合物的分子式为Ｃ↓［２８］Ｈ↓［２０］Ｏ↓［１２］，其特征在于其［１］↑ＨＮＭＲ光谱（附图９）和［１３］↑ＣＮＭＲ光谱（附图１０）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：NVS拉马克瑞世纳，KHS斯瓦迈，EKSV库马，MMS库史瓦赫，S寇塔，M拉曼，SD塔尔，SK得士穆克，D斯库密尔，M克尔兹，H寇格勒尔，
申请(专利权)人：阿文蒂斯药物德国有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]