获得L-二氢乳清酸的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种通过在阴离子交换材料上、于碱水混合物中、约１．１ＭＰａ至约４０ＭＰａ压力下进行层析得到Ｌ－二氢乳清酸的方法。该方法可以用来研究Ｎ－４（三氟甲基苯基）－５－甲基异＊唑－４－甲酰胺、Ｎ－４（三氟甲基苯基）－２－氰基－３－羟基丁烯酰胺及类似化合物的体内和体外活性。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种通过在阴离子交换材料上、于碱水混合物中约1．1MPa至约40MPa的压力下进行层析得到L-二氢乳清酸(此后称作“L-DHO”)的方法。该方法可适用于研究N-(4-三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羟基丁烯酰胺及类似化合物的体外和体内活性。利用硅胶层析法、随后通过化学衍生法和比色分析法可以测量出L-DHO(Kesner，L．，Aronson，F．L．，Silverman，M．，Chan，P．C．，《临床化学》(Clin．Chem)21／3(1975)353)。另一种方法是令L-DHO在由大鼠肝脏制备的L-二氢乳清酸脱氢酶(此后称为“DHODH”)的酶促作用下转化为乳清酸，进而化学衍生化，再通过比色变化来检测乳清酸盐(酯)(Rogers，L．E．，Nicolaisen，K．，《经验》(Experientia)28／10(1972)1259)。这些方法的缺点在于，复杂生理溶液中所含的其他物质对检测造成干扰。此外，上述方法极其耗时，这归因于样本制备繁杂，所以无法在大规模的临床研究中用作常规分析。在尝试改进获得L-二氢乳清酸的分离和离析方法中，现已发现通过在碱水混合物中、于阴离子交换材料上约1．1MPa-约40MPa的压力下对L-DHO进行层析可获得相同的结果。该方法可用于定量检测细胞溶解产物、哺乳动物血清和人血清中的L-DHO。此方法具有高度的重现性、灵敏度和有效性。如权利要求书所述，本申请通过采用一种包括下列步骤的层析方法达到了该目的a)获得含有耐压阴离子交换材料的层析柱；b)将含有L-二氢乳清酸的样本溶液进样至该层析柱中；c)进行层析；d)用含有碱水混合物的洗脱剂来洗脱L-二氢乳清酸；该方法是在约1．1MPa-约40MPa的压力下进行。术语“耐压阴离子交换材料”是指材料，例如，被链烷醇季铵改性的大孔(2000 二乙烯基苯／乙基乙烯基苯的聚合物或与二乙烯基苯交联的微孔聚乙烯基苄基铵聚合物或者其混合物；或乙烯基苄基氯／二乙烯基苯的大孔聚合物；或交联聚乙基亚氨基聚合物；或用丙基三甲基铵改性的二氧化硅；或聚(苯乙烯-二乙烯基苯)三甲基铵。下列产品是特别优选的Ion Pac As 11、CarboPac PA 1或CarboPac MA 1阴离子交换层析柱，由Dionex公司。Idstein，德国提供；GROM-SIL，Strong Anion．或GROM-SIL，Weak Anion．；由Grom提供；P 1000 SAX，Ionospher SA或Chrompack PA由Chrompack提供；PRP-X 100或RCX-10，由Hamilton提供。洗脱剂含有碱水混合物。适用的碱衍生自碱金属或碱土金属，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁或氢氧化钙。基于作为溶剂的水，碱的浓度是1mmol／l-约200mmol／l，优选2mmol／1-约120mmol／l，更优选100mmol／l。层析过程中的温度约为0℃-约50℃，优选约15℃-约30℃，更优选约19℃-约25℃。层析中的工作压力基本恒定。层析也可以在不同的压力下进行，例如可以在约1．1 106Pa(1．1MPa)-约40106Pa(40MPa)，优选4．1MPa-5．5btPa的压力下进行。洗脱剂的流速约为0．2ml／分钟-约3ml／分钟，优选1ml／分钟。层析柱的填装、层析以及L-DHO的洗脱均采用已知的常规技术法。适用的洗脱过程是其中碱浓度表现为时间的梯度，特别是该梯度呈线性过程的洗脱。该浓度梯度可以通过例如在洗脱初始时令洗脱剂中含有低浓度的碱(极限情况中为0)，并且在洗脱过程中提高碱的浓度来实现。此方法能够极其有效地分离出衍生自血清或细胞溶解产物的样本中的L-DHO。优选的碱梯度是在约1％NaOH(100mmol／l)和99％水(洗脱开始时)-约60％NaOH和40％水(在洗脱结束时)内变化，特别优选介于约1％NaOH和99％水(洗脱开始时)-约15％NaOH和75％水(在洗脱结束时)的范围内。碱水梯度在2．5分钟-约14分钟和14分钟-约25分钟间呈线性方式改变，其中，在这两个时间段中梯度的陡度并不相同。更适当的洗脱可通过在分离过程开始时采用约为1％的低碱浓度且使其保持约2．5分钟来获得。其结果是从层析柱的生物基质中洗脱绝大多数干扰物。通过在总共14分钟的测定时间段中使碱的梯度缓慢升高至约23％碱来分离出被分析物。随后，碱浓度在4分钟内升高至约60％以便洗脱出强结合的物质。使用60％碱应不超过6分钟，马上用1％的碱水混合物再平衡。下一次的分析是在总长45分钟的分析时间之后进行。碱水混合物中的水需经过去离子化和脱气处理。本专利技术的分离方法是在柱过程中进行的。适宜在阴离子交换层析法中保持恒定的温度可在很宽的范围内变化。优选的温度范围是约-10℃-约50℃，更优选约15℃-约25℃。对L-DHO的洗脱发生在梯度开始后的第10分钟-12分钟之间。洗脱过程的进行时间为13分钟-25分钟。利用电导检测器，例如Dionex公司提供的CD20型，来检测L-DHO。为了使基线漂移减至最小并降低背景导电率，可以采用阴离子自再生抑制器，例如Dionex公司的ASRS-1型，4mm。本专利技术所述的方法特别适用于分析层析法，但也可以用于制备层析法，尤其当本专利技术所述方法采用的是制备性高压液相层析柱(HPLC)体系时。术语“制备性层析”是指目的在于得到而不仅是分析纯净产物的提纯方法。纯净产物的量可以在很宽的界限内改变，例如1mg-1000g，优选50mg-500mg。本专利技术的方法可以用来检测因抑制二氢乳清酸脱氢酶(DHO-DH)所致的细胞内或细胞外L-DHO浓度的变化。DHO-DH酶负责嘧啶从头合成过程中由L-二氢乳清酸转化为乳清酸。对DHO-DH的抑制将导致L-DHO累积。本专利技术的方法可用于制剂的诊断分析。本专利技术的方法可以用来测定DHO-DH抑制剂的活性。DHO-DH抑制剂例如是N-4-(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、布喹那(Brequinar)、N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羟基庚-2-烯-6-炔-甲酰胺、2-氰基-3-环丙基-3-羟基丙烯酸-(4-氰基苯基)-酰胺或N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-3-羟基丁烯酰胺。本专利技术的方法可以用来检测植物、细胞系、动物和人体中的L-DHO浓度。对L-DHO的测定可用来监控DHO-DH抑制剂在植物、哺乳动物和人体中的活性。本专利技术所述方法将在下列实施例中作详细描述。除非另外说明，百分比数据均是指重量百分率。实施例11．1化学品和试剂化学品和试剂购得如下无NaOH和KOH的碳酸盐Baker，HollandL-二氢乳清酸(L-DHO)Sigma，MunichHClO4Riedel de Haen，Seelze曙红，氯仿 Riedel de Haen，SeelzeRPMI 1640培养基Gibco，Eggenstein胎牛血清(FCS) Bio Whitaker，Verviers，Belgium去离子水在使用前用氦气脱气1．2层析仪器HPLC系统是由下列设备构成<tables id="table1" num="001">&本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过层析法获得Ｌ－二氢乳清酸的方法，该方法包括下述步骤：ａ）获得含有耐压阴离子交换材料的柱子；ｂ）将含有Ｌ－二氢乳清酸的样本溶液加样至该柱中；ｃ）进行层析；ｄ）用含有碱水混合物的洗脱剂来洗脱Ｌ－二氢乳清酸；该方法是在约１．１ＭＰａ－约４０ＭＰａ的压力下进行的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：U米尔伯特，R巴特莱特，E鲁斯，C福达里，
申请(专利权)人：阿文蒂斯药物德国有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]