连续式高处理量筛选制造技术

本发明专利技术涉及应用了至少一种多孔基质的连续式高处理量筛选方法（ＣＦ－ＨＴＳ），该方法使得制药工业能够同时对大量生物学或生化活性分布广泛的化学实体进行筛选。此外，ＣＦ－ＨＴＳ也可用于进行多步骤的检测实验。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及应用了至少一种多孔基质的连续式高处理量筛选方法(Continuous format high throughput screening，CF-HTS)，该方法使得制药工业能够同时对大量生物学或生化活性分布广泛的化学实体进行筛选。此外，CF-HTS也可用于进行多步骤的检测实验。
技术介绍
生物学和生物化学检测实验的设计是为了对各种各样系统的活性进行测试，其中包括从蛋白-蛋白相互作用、酶催化、小分子-蛋白结合到细胞功能。在“高处理量筛选方法”(HTS)中应用了这些检测实验测试大量化学实体以探索这些化学实体先前未知的生物学或生物化学功能。一步(homogenous)和多步(heterogeneous)检测实验所有不同种类的生物学检测实验都可归成两个大类一步检测实验和多步检测实验。在一步检测实验中，同时加入所有的试剂，并测量或解释结果而无需另外的操作。例如，在皮氏培养皿中培养的细胞可用化学物质处理。如果化学物质对细胞是毒性的可通过简单地观察变清澈的区域而判断毒性。另一个例子是可以使用表达蛋白的细胞，所有表达蛋白能改变该细胞的颜色。生长于含X-gal琼脂上的表达β-半乳糖苷酶(β-gal)的细胞这个例子中，根据β-gal蛋白表达量的不同细胞会不同程度地变蓝。因此对于任何影响报告基因，如β-半乳糖苷酶基因表达的生物学过程，可设计一个一步检测实验。一步检测实验的另一例子是利用一种在酶的作用下改变颜色或荧光的底物。最后，如Amersham的邻近闪烁检测(Scintillation Proximity Assays，SPA)，这样的技术能直接测量放射性标记的配基与固定到含闪烁剂小珠上的蛋白或任何配基结合物质的结合。以上所有的例子都是一步检测实验的例子，因为它们除了在最后的探测、测量或读取信号之前加入试剂外不需要任何另外的步骤。另一方面，多步检测实验需要至少两个不能合并成一步的步骤，因为这些步骤不同程度上固有地不相容。例如，许多多步检测实验要求按一定的顺序加入试剂(例如一些试剂将影响前面的步骤，但对于完成后面的步骤又是必须的)。这种情况的常见例子包括需要加入信号显示试剂以间接地报告反应产物的存在或浓度的检测实验。在多步检测实验中另一常见的步骤是洗涤步骤。在检测实验前期步骤中通常需要加入过量检测试剂，但在随后的步骤中需要洗去以便随后进行的实验不会出现过高的背景信号。例如，在放射性配基结合实验中，首先将标记的配基与结合到固相表面上的蛋白温育，但这些配基中只有一小部分真正结合有限的蛋白位点。温育后，在能准确测量结合的放射性配基之前，必须将过量的未结合配基洗去。洗涤可通过多种供选的方法完成，包括过滤、重复洗涤／倒干、沉淀／分相和／或离心。许多生物学和生物化学过程只能通过多步检测方法测量。进而，尽管存在通过调整其他生物学或生物化学过程使之适合一步法的途径，但使用多步法可使这些其他过程更有效地发挥作用，或可以使用更容易得到的试剂进行操作。给出的多种一步检测技术的方法和试剂盒如SPA(Amersham)，荧光极化(Jolley公司和其它公司)和时间分辨荧光技术(Packard公司和其它公司)中只有少数是可由商业途径获得。而且，使用这些方法总是需要更多的费用和时间。对于多数检测而言，多步法可以更好地建立，并且更易于快速显示结果。因此，多步法，如ELISA、过滤结合、RIA、荧光素酶细胞检测实验等等的应用仍然很广泛。下文将就这些方法中的一些做法更为详细地描述。高处理量筛选(HTS)多年以来，制药工业越来越依赖于筛选化合物库的HTS以发现候选药物。HTS是指一种平行测试许多离散化合物以便同时或几乎同时筛选大量测试化合物的生物学活性。目前，使用最广泛的方法采用了96孔微量滴定板。在这种方式中，在一块含96个反应孔的8cm×12cm的塑料板上同时进行96个独立的测试。这些孔要求的检测容量通常为50-500μl。对于许多一步和多步检测实验而言，除了板外，还可从商业途径获得多种与这种96孔板方法配套的仪器、材料、移液器、机器人、洗板机、和读板仪等等。迄今为止，改进HTS的努力集中于使孔更小(小型化)。因为如果减小孔的大小就可以增加每块板上孔的数量，从而提供更多的平行测试。进而，通过减小检测实验的体积可以减小每次测试的试剂费用。进而，因为可以更小的体积进行更多的平行测试，从而可以同时测试更多化合物以发现候选药物。目前为止，通过提供384孔(96×4)的方式稍稍改进了96孔技术。参见Comley et alJ．Biomol．Screening，vol．2(3)，pp．171-78(1997)。事实上，密度更大的方式已有报道，包括9600孔的方式。但是，小型化必然会带来费用和复杂性的问题。这些费用和复杂性问题与使筛选方式小型化的三个主要部分直接相关。首先，必须能使测试容器(管、孔、凹窝等等)小型化。其次，必须能将所有必需的测试试剂精确地分加到更多且更小的孔中(通常通过液体处理机器人加入到多个孔中而完成)。第三，必须能从高密度的排列“读取”测试结果。就平行独立检测实验的要求而言，各种部分都挑战或限制着多大程度上小型化是可行的，或在费用上是有效的。例如，一种新的更小型的方式可能需要完全不同的分加试剂的方法，或需要分辨率、灵敏度、和工程技术上与新的小型化方式相容的读数仪器。如果减小了每个孔的大小，那么制造容器阵列、分加更小量试剂和每个测试样品的读数变得更困难，更消耗时间并更昂贵。并且，由于分加更小体积的试剂和测量更弱的样品信号时固有的不准确性，更小的样品量也将增加样品与样品之间的统计可变性。进而，当样品量减小到一定水平以下时，诸如蒸发和表面张力这样的因素甚至给实施新的小型化方式增加了更高的费用和更大的复杂性。对于HTS技术在量上的进步，制药工业急切需要“自由式检测实验”或在样品之间无物理隔离的可能。这种技术通常被想象为在没有任何孔的情况下测试小液滴，但真正用常规的离散化合物汇集进行自由式的HTS检测还未见报道。组合文库的筛选-胶渗入方法随着组合化学的到来，可以在固相支持物(通常为小珠)上迅速生产以百万计的化学实体。尽管96孔方式正被用于筛选基于小珠的文库，但是这种方式通常被认为效率不高，因为(1)每个小珠只带有小量的化学实体；(2)待测试的化合物数量极其大；(3)将小珠加入96孔微孔板的操作很困难。为了避免用96孔方式筛选组合文库时固有的问题，有些人报道了可被称为“自由式”的简单一步检测法的应用。举个例子，Jayawickremeet al在Proc．Nat’l Acad．Sci．(USA)，vol．191，pp．1614-18(March，1994)中报道了在组合肽库的一个简单一步检测中使用了色素细胞(黑色素细胞)。根据作者，他们将细胞放在有盖培养皿中的琼脂下，然后将带有组合化合物的小珠放在琼脂的表面上，让化合物从小珠上部分释放到琼脂中。活性物质表现为黑色区域，因为当化合物局部扩散到凝胶介质中时，该活性物质使细胞改变颜色。另一个最近的例子是Daniel Chelsky在Philadephia，PA的生物分子筛选协会第一届年会(First Annual Conference of The Society forBiomolecu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测测试样品的生物学或生物化学活性的方法，该方法包括，ａ）将多种测试样品引入到多孔检测基质之中或之上，检测基质任选地含有一种或多种检测组分，ｂ）使用至少一种基质将一种或多种检测组分引入到检测中，其中所述基质可以是也可以不是多孔检 测基质，ｃ）进行以下另加步骤，ｉ）洗涤检测中用的任一基质以除去多余的测试样品、检测组分或两者；或者ｉｉ）使检测中使用的任一基质和批量溶液或其本身为液体另加试剂接触。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：BA比特尔，ME舒达克，MJ沃二巴斯，DJ布尔恩斯，MK约瑟夫，
申请(专利权)人：艾博特公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]