新的突变谷氨酰胺合成酶和产生氨基酸的方法技术

含有如序列表中的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的氨基酸序列的谷氨酰胺合成酶，其中对应于ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的３９７位的酪氨酸残基被酪氨酸残基以外的氨基酸残基取代。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物工业，具体涉及产生氨基酸的方法。更具体地，本专利技术涉及一种新的酶的用途，该酶参与产氨基酸的大肠杆菌菌株的谷氨酰胺生物合成和氮素同化作用。更具体地，本专利技术涉及一种新的突变谷氨酰胺合成酶和一种用具有该酶的大肠杆菌菌株产生谷氨酰胺、精氨酸、色氨酸、组氨酸和谷氨酸等氨基酸的方法。由于GS在细胞代谢中的多种功能和重要性，它的催化活性和它的合成都得到了高度调节。GS的总体结构由12个亚基组成，这些亚基排列为两个面对面的六聚物。GS的每个亚基的Tyr-397的腺苷酰化作用下调体内的酶活性。GS的腺苷酰化作用和去腺苷酰化作用都是由glnE基因编码的腺苷酰基转移酶(adenyltransferase)催化的。催化方向由调节蛋白PII(glnB)所规定，该蛋白的活性也是由可逆性修饰所调节PII的未修饰形式激活腺苷酰化，其尿苷酰化形式激活GS的去腺苷酰化作用。特异性的尿苷酰基转移酶催化尿苷酰基从UTP转移到PII，而尿苷酰基去除活性逆转PII的尿苷酰化。这两种活性都取决于glnD基因。谷氨酰胺刺激尿苷酰基去除活性，2-酮戊二酸刺激PII的尿苷酰化作用。因此，谷氨酰胺最终导致GS的腺苷酰化，而2-酮戊二酸促进去腺苷酰化(活性形式)GS的形成(Escberichia coliand Salmonella，SecondEdition，Editor in ChiefF.C.Neidhardt，ASM Press，WashingtonD.C.，1996)。已经描述过来自于不同物种的突变的不可腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶。有来自于中华根瘤菌的突变GS(Arcondeguy等，FEMS Microbiol.Lett.，1996，1451，33-40)，来自于深红红螺菌的Y398F突变GS(Zhang等，J.Bacteriol.，2000，1824，938-92)和来自于维涅兰德固氮菌的Y407F突变GS(Colnaghi等，Microbiology，2001，1475，1267-76)。这里提到的突变GS表现出天然酶的活性水平。但还没有报道用缺乏腺苷酰化能力的突变GS产生氨基酸。在本专利技术中，提出了用glnA基因中编码苯丙氨酸残基的TTT密码子取代编码GS蛋白中397位的酪氨酸的TAT密码子。氨基酸序列中氨基酸残基的取代导致了具有天然活性水平和无腺苷酰化的突变蛋白的表达。发现上述突变GS变得对谷氨酰胺的间接下调不敏感。然后本专利技术人发现用具有突变glnA基因的DNA转化的属于埃希氏菌属的产谷氨酸细菌变得可以产生谷氨酰胺。因此完成了本专利技术。本专利技术提供了以下内容(1)含有如序列表中的SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的谷氨酰胺合成酶，其中对应于SEQ ID NO1的397位的酪氨酸残基被酪氨酸残基以外的氨基酸残基取代。(2)根据(1)的谷氨酰胺合成酶，包含一种在序列表中的SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的397位以外的一个或多个位置具有一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列。(3)根据(1)或(2)的谷氨酰胺合成酶，其中对应于序列表中的SEQ IDNO1的397位的残基被苯丙氨酸残基取代。(4)根据(1)-(3)的任意一项的谷氨酰胺合成酶，其中该谷氨酰胺合成酶分离自大肠杆菌。(5)编码根据(1)-(4)的任意一项的谷氨酰胺合成酶的DNA。(6)根据(5)的DNA，该DNA为以下(a)或(b)所定义，其中对应于397位的酪氨酸残基的密码子被酪氨酸以外的氨基酸的密码子替代(a)含有序列表中的SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA；或(b)在严格条件下可与序列表中的SEQ ID NO2的核苷酸序列杂交的DNA，编码具有谷氨酰胺合成酶活性并对谷氨酰胺的间接下调作用不敏感的蛋白的DNA。(7)根据(6)的DNA，其中严格条件为在60℃，相当于1×SSC的盐浓度和0.1％的SDS的条件下进行洗涤。(8)一种用(5)-(7)的任一项的DNA转化的细菌。(9)根据(8)的细菌，该细菌属于埃希氏菌属。(10)根据(8)或(9)的细菌，该细菌具有产L-氨基酸的能力。(11)一种产生L-氨基酸的方法，该方法包括以下步骤在培养基中培养根据(8)-(10)的任意一项的细菌，以便在培养基中产生和聚集L-氨基酸，以及从培养基中收集L-氨基酸。(12)根据(11)的方法，其中L-氨基酸选自L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、和L-谷氨酸。(13)根据(12)的方法，其中L-氨基酸为L-谷氨酰胺。如上所述的对应于序列表中的SEQ ID NO1的397位的酪氨酸残基处具有取代的GS可以称作“突变GS”，编码突变GS的DNA可以称作“突变glnA基因”，没有该取代的GS可以称作“野生型GS”。在本说明书中，除非特别指出，氨基酸是L构型。进一步，将详细解释本专利技术。(1)突变GS和突变glnA基因已知397位的酪氨酸是GS的腺苷酰化作用位点(该酶的氨基酸残基编号根据G Colombo和JJ Villlafranca(J.Biol.Chem.，Vol.261，Issue 23，10587-10591，1986)而定位)。在野生型GS的氨基酸序列中用任意氨基酸，优选苯丙氨酸取代对应于397位的酪氨酸的氨基酸残基，导致具有天然活性水平和无腺苷酰化的突变蛋白的表达。突变GS变得对谷氨酰胺的间接下调作用不敏感。可以通过用常规技术将突变引入野生型glnA基因而获得基于序列的突变GS。作为野生型glnA基因，可以提到大肠杆菌glnA基因(在GenBank编号AE000462 U00096SEQ ID NO2的序列中的6558-7967号核苷酸)。突变GS可以包含在397位以外的一个或多个位置的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，前提是GS活性没有破坏。“GS活性”表示催化用ATP从谷氨酸和氨形成谷氨酰胺的反应的活性。“几个”氨基酸根据在蛋白三维结构中氨基酸残基的位置或类型而不同。这是因为以下原因。即，一些氨基酸之间具有高度同源性，这种氨基酸的差别不显著影响蛋白的三维结构。所以，本专利技术的突变GS与构建GS的完整氨基酸残基相比可以具有不低于30-50％的同源性，优选具有50-70％的同源性，并且具有GS活性。在本专利技术中，“对应于397位的氨基酸残基”表示对应于SEQ IDNO1的氨基酸序列中的397位的氨基酸残基。氨基酸残基的位置可以改变。例如，如果在N端部分插入氨基酸残基，本来位于397位的氨基酸残基成为398位。在这种情况下，对应于原来的397位的氨基酸残基被指定为本专利技术的397位的氨基酸残基。可以获得编码与上述突变GS基本相同的蛋白的DNA。例如，可通过如定点诱变法，使在特定位点的一个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入或添加，从而修饰核苷酸序列。如上所述进行修饰的DNA可以通过常规的已知突变处理而获得。上述核苷酸缺失、取代、插入或添加也包括天然存在的突变(突变体或变体)，例如基于具有GS的细菌个体差异或细菌种或属内差异的天然存在的突变。编码这种变体的DNA可以通过分离与glnA基因或部分该基因在严格条件下杂交的DNA以及编码具有谷氨酰胺合成酶的蛋白的DNA而获得。名词“严格条件”在此处是指能够形成所说的特异性杂交，而不形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：M·M·古斯亚蒂纳，L·V·伊瓦诺维斯卡亚，T·V·利奥诺瓦，E·I·慕哈诺瓦，Y·G·罗斯托瓦，D·V·菲利珀，D·A·丘达科瓦，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：