利用小单孢菌将密实菌素羟基化为普伐他汀制造技术

本发明专利技术涉及一种通过浸没培养在有氧条件下能够对式（Ⅱ）化合物进行６β－羟基化的菌株并分离和纯化在生物转化过程中形成的式（Ⅰ）化合物，由通式（Ⅱ）的化合物制备式（Ⅰ）化合物的新微生物方法，其中Ｒ代表碱金属或铵离子。所述方法包括以下步骤：在２５－３２℃下在一种含有可利用的碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上培养小单孢菌属菌株，该菌株能够对通式（Ⅱ）化合物进行６β－羟基化，其中Ｒ如上所定义，然后将需要被转化的底物添加到生长的培养物中，然后对底物进行羟基化直至完成生物转化，然后从培养液中分离式（Ⅰ）化合物，如果需要，纯化该化合物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备普伐他汀的新微生物方法。更具体地是，本专利技术涉及一种利用微生物由通式(II)的化合物制备式(I)的普伐他汀的微生物方法 其中R代表一种碱金属或铵离子，其中所述微生物是一种属于小单孢菌属(Micromonospora)的原核生物，其能够在6β-位置上羟基化通式(II)的化合物。
技术介绍
高胆固醇血症被认为是动脉粥样硬化疾病，尤其是冠心病的一种主要危险因素。在过去的二十年中，已经对作为胆固醇生物合成过程中的主要限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶EC.1.1.1.34)进行了广泛的研究。通过不同真菌菌种的选择菌株生物合成的美维诺林(Mevinolin)及其相关化合物被发现是该酶的竞争性抑制剂。普伐他汀也是HMG-CoA还原酶抑制剂家族中的一员。首先，在对密实菌素的代谢进行研究的过程中，发现普伐他汀是狗体内一种密实菌素的次要尿代谢物(Tanaka，M.等，未公开)。作为密实菌素的羟基化产物的普伐他汀的主要特征是它的组织选择性。该药物强烈地抑制甾醇在肝内和肠内的合成，但在其它器官，抑制作用较弱。有利的是普伐他汀的毒性低于其它HMG-CoA还原酶抑制剂的毒性。据报道通过属于多种不同真菌属的种的几种菌株，以及通过属于诺卡氏菌属(Nocardia)，马杜拉放线菌属(Actinomadura)和链霉菌属(Streptomyces)的放线菌种的菌株，尤其是玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)和嗜碳链霉菌(Streptomycescarbophilus)，可在不同程度上实现密实菌素的微生物羟基化(美国专利5179013，4448979，4346227，4537859，及日本专利58010572)。利用真菌由密实菌素制备普伐他汀的过程中存在的问题是这些生物体通常耐受不了液体培养基中较高的密实菌素浓度，这大概是由于密实菌素具有抗真菌活性。在嗜碳链霉菌中，已表明细胞色素P450系统为密实菌素被羟基化为普伐他汀所必需的。遗传改进这种酶羟基化能力的困难在于该酶是一种蛋白质复合体而不是单个蛋白质。本专利技术的公开我们的研究集中在寻找一种放线菌菌株，该菌株能由酸式密实菌素的盐产生普伐他汀，该菌株在生物转化中采用的底物浓度以及转化率比上述专利说明书中公开的那些高。在筛选过程中，筛选包括了大约6000个放线菌菌株，大多是我们自己的分离物，但也包括来源于国际菌株保藏中心的可靠菌株，选出五个链霉菌菌株和五个小单孢菌菌株用于进一步的研究，因为它们被证明具有将酸式密实菌素的钠盐羟基化为普伐他汀的能力。我们实验室已在种的水平上对这十个放线菌菌株中的八个菌株进行了分类学鉴定，这十个放线菌菌株是紫色链霉菌(Streptomyces violaceus)(根据Kmpfer等，1991)，菌株号1/43；娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)(Berger等，1949；Waksman和Lechevalier，1953)，菌株号1/41；拒霉素链霉菌(Streptomyces resistomycificus)(Lindenbein等，1952)，菌株号1/44；链霉菌属的种(Streptomyces sp.)，菌株号1/28；羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)(Frommer，1959)，菌株号1/16；小单孢菌属(Micromonospora sp.)，菌株号IDR-P3；绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)(Luedemann和Brodsky，1964)，菌株号IDR-P4；棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)(Luedemann和Brodsky，1964)，菌株号IDR-P5；黑孢小单孢菌(Micromonospora megalomicea)(Weinstein等，1969)，菌株号IDR-P6；蔷薇小单孢菌(Micromonospora rosaria)(Horan和Brodsky，1986)，菌株号IDR-P7。迄今为止，还没有文献公开有关小单孢菌具有将酸式密实菌素的盐转化为普伐他汀的能力的数据，所以我们不仅全面地研究了该特定酶促能力，而且还研究了上面列出的小单孢菌属菌株的分类学位置。，DR-P3，IDR-P4，IDR-P5，IDR-P6和IDR-P7在属水平上的分类学位置所有这些菌株产生生长良好的菌丝体，该菌丝体由0.4-0.7μm直径的分支菌丝组成。不存在气生菌丝体或只存在微量的气生菌丝体。只在孢子体上长出不动孢子。基内菌丝体的菌丝是革兰氏阳性的并且不耐酸。菌株IDR P3-P7是需氧的，化能有机营养的并对低于6.0的pH敏感。壁含有内消旋-二氨基庚二酸。上面列出的鉴别特征-为关键特征-清楚地表明这些单孢放线菌菌株是小单孢菌属的典型成员。小单孢菌属菌株IDR-P3的分类学描述微观形态学特征基内菌丝体由生长良好的、略为弯曲的、单轴分支的细丝组成。孢子体上的孢子是单个的，大约1.8μm直径的球形体并且或多或少地均匀分布在菌丝上。孢子是无柄的(sessile)或位于短孢子体的端部。大概由于成熟孢子释放得非常快，所以在肉汤培养基中菌丝上没有观察到孢子。培养的宏观形态学特性Czapek-蔗糖琼脂中等生长，菌落微红色并覆盖点状黑色孢子形成区域。葡萄糖-天冬酰胺琼脂生长情况被记录为点状和凸起的、红棕色或黑色菌落。可扩散性色素微红。营养琼脂中等生长，凸起的、红棕色或黑色菌落。在培养基中产生红棕色外色素(exopigment)。酵母抽提物-麦芽提取物琼脂(ISP Med.2)生长良好的、凸起的和褶皱的褐色菌落，覆盖部分黑色孢子形成区域或“假气生菌丝体”(看上去象一种有限的发白的或浅灰色的花)。可溶性色素呈褐色或呈棕红色。无机盐-淀粉琼脂(ISP Med.4)中等生长的、红棕色的、凸起的和褶皱的菌落。可溶性色素浅红色。甘油-天冬酰胺琼脂(ISP Med.5)痕量生长，偏白或浅桔黄色的扁平菌落，可溶色素浅玫瑰色。碳源的利用生长良好并且很好地利用L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、D-甘露糖醇、半乳糖醇、甘油和肌醇。利用L-鼠李糖、D-棉子糖和菊粉的生长比在阴性对照培养基上生长得略好些。氮源的利用利用酵母抽提物和NZ-胺生长良好，不利用或很少利用NaNO3。其它生理生化特征水解纤维素和淀粉，对牛奶的消化性强。硝酸盐还原反应试验阴性。在不含碳酸钙(pH5.8-6.0)的马铃薯片上不生长。不产生类黑素。从Balaton湖(匈牙利)的泥浆样本中分离了小单孢菌属的该菌株IDR-P3。分类学位置为了弄清该菌株在小单孢菌属的种中的精确分类学位置，有必要进一步进行比较系统学研究。基于一定的特征基础，IDR-P3代表小单孢菌属的一个新种似乎并不是不可能。小单孢菌属菌株IDR-P4、-P5、-P6和-P7的鉴别特征的描述和鉴定菌株IDR-P4在以上列出的鉴别培养基上，菌落通常生长良好，颜色由桔黄色到桔红色，红色，有时为微黄色或玫瑰色。不产生可溶性色素和气生菌丝体。单体孢子数较少。它们长在孢子体的末端。基内菌丝体由完全分支的菌丝组成。没有气生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过浸没培养在有氧条件下能够对式（Ⅱ）化合物进行６β－羟基化的小单孢菌属菌株并分离和纯化在生物转化过程中形成的式（Ⅰ）化合物，由通式（Ⅱ）的化合物制备式（Ⅰ）化合物的微生物方法，＊＊＊其中Ｒ代表碱金属或铵离子，该方法包括 以下步骤：（ａ）在２５－３２℃下在一种含有可利用的碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上培养小单孢菌属菌株，该菌株能够对式（Ⅱ）化合物进行６β－羟基化，其中Ｒ如上所定义，然后（ｂ）将需要被转化的底物添加到生长中的培养物中，然后　 　（ｃ）对底物进行羟基化直至完成生物转化，然后（ｄ）从培养液中分离式（Ⅰ）化合物，如果需要，纯化该化合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A杰克尔，G阿姆布鲁斯，E伊尔克伊，I霍瓦斯，A孔亚，IM斯扎博，Z纳吉，G霍瓦斯，J默泽斯，I巴塔，G索莫格伊，J萨拉特，S伯罗斯，
申请(专利权)人：伊瓦克斯药品研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：HU[匈牙利]