从湿菌体中提取高纯度PHAs（聚羟基烷酸酯）的方法技术

一种从湿菌体中提取高纯度ＰＨＡｓ（聚羟基烷酸酯）的方法，该方法包括一种直接从湿的生物质中提取聚羟基烷酸酯的方法，以及一种得到高纯度聚羟基烷酸酯的方法。具体操作步骤是：浓缩发酵液，收集菌体；加入有机溶剂于上述湿菌体中溶解高分子；分离去残渣，保留溶有ＰＨＡｓ的有机相；任选地，可以将溶有ＰＨＡｓ的有机相浓缩，即可得到ＰＨＡｓ产品；任选地，可用非溶剂处理溶有ＰＨＡｓ的有机相，沉淀即为ＰＨＡｓ。所得ＰＨＡｓ用极性非溶剂处理，过滤，晾干或烘干即可得到高纯度ＰＨＡｓ产品，其纯度为９９．０％以上，提取收率为９５．０％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及从细菌等生物体系中直接用有机溶剂提取聚羟基烷酸酯的方法，主要是指一种从湿菌体中提取高纯度聚羟基烷酸酯的方法湿法提取法。
技术介绍
聚羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoates，简称PHAs)通常是微生物在不平衡生长条件下在细胞内积累的用于储存碳源和能量的颗粒状物质，是一种物理性质类似于聚乙烯、聚丙烯等化学合成塑料的热塑性聚酯，但它具有一般合成塑料所不具备的特性生物降解性、生物相容性、压电性、光学活性等，被认为是一种“新型生物可降解材料”而倍受重视。 由于在基因工程菌株构造方面的进展，尤其是在代谢工程方面的成功，PHAs的发酵技术已经有了很大的发展。目前的技术已经使PHAs这类可完全生物降解材料在生产成本方面接近以石油为来源的塑料，在性能方面能够满足其性能多样性的要求。PHAs部分甚至大部分取代不可降解塑料即将成为现实。 目前影响PHAs的广泛应用主要是其提取成本较高以及高分子的纯度较差，而PHAs的提取方法是影响其生产成本及高分子纯度的主要因素。PHAs的提取方法主要分为有机溶剂法和水相提取法(非有机溶剂提取法)。水相提取法包括次氯酸钠法、表面活性剂-次氯酸钠法、酶-表面活性剂法。水相提取法(非有机溶剂提取法)的缺点是①对分子结构尤其是分子量破坏较大；②提取的总成本高，废水处理麻烦；③最为严重的是非溶剂提取方法所得到的高分子纯度很难达到97％以上，总是有少量的无机盐或蛋白质等杂质，这些杂质在后期加工中对产品的性能影响相当大，尤其是对成膜制品，这些少量的杂质影响了膜的机械强度，而且在加工条件下会加速分子量的降解。 有机溶剂提取法传统的观点是该方法要用大量的有机溶剂，而且传统的观点更认为只有少量的含卤的有机溶剂如氯仿、二氯甲烷才能溶解PHAs，而这些含卤的溶剂由于对环境危害较大而认为不宜作为提取溶剂；同时现有的方法都将发酵后的菌体进行干燥，再加入有机溶剂，由于菌体干燥过程中易成团成块，机械粉碎虽然可以得到较细的颗粒，但与单个的菌体相比其表面积要小得多，提取效率很慢；且菌体的干燥需消耗较多能量，从而大大增加了总成本。 艾萨奥.诺达提出了使用临界的PHA非溶剂加速从生物质中用溶剂提取PHAs的方法。该方法包括a)用PHA溶剂和临界的PHA非溶剂处理生物质；b)除去任何不溶的生物质，剩下PHA和临界的PHA非溶剂的溶液；c)从溶液中除去PHA溶剂，得到沉淀的PHA在临界的PHA非溶剂中的悬浮液。任选地，该方法还包括除去临界的PHA非溶剂，剩下的是多羟基链烷酸酯。该方法的缺点是没有考虑到其高沸点非溶剂在生物残渣(提取高分子后的)中的损失。如果不回收，显然非溶剂的损失将增加总溶剂的使用量，从而增加总的成本；如果回收，由于其高沸点，回收成本高，使总的生产成本变高。同时该方法在除去溶剂的过程中会形成类似于凝胶的小颗粒，这样的凝胶小颗粒会将体系中的杂质(溶于非溶剂)“包住”，过滤干燥后，这些“包住”的杂质很难除去。因此，该方法得到的产物带有颜色，其纯度很难达到99％以上，很难适合类似于医用、食品包装类的产品。艾萨奥.诺达在另一个专利[2005年1月19日公开的专利声请公开号CN 1566068A]中提出了“油和PHA的一步提取法和随后的溶剂洗提”、“油和PHA的一步提取法和随后的非溶剂引发的沉淀”、“油和PHA的两步连续提取法”，这些方法的缺点是①都是针对植物或含油生物质，现阶段，在植物体内PHA含量都非常低，据报道最高含量是在拟南芥叶片中poly(3HB)含量约为14％(以干重计)，在微生物发酵液中不适合，以该方法提取产率低；②丙酮提取时间长，且对湿菌体效率低下，一般湿菌体中至少含有50％的水，若将其干燥，增加了工艺程序，增加提取的成本；③生物残体中损失的有机溶剂过多。 陈国强等提出了一种用五和/或四碳醇中的一种或几种自形成聚羟基脂肪酸酯的湿/干细胞菌体破壁提取聚羟基脂肪酸酯。该方法的缺点是①破壁提取时间长，需1～10h，效率低；②使用五和/或四碳醇，回收困难，溶剂损耗量增加，生产成本相对增高；③得到的产物纯度低(小于96％)；④PHAs提取收率低，且需要进行预处理，增加了工艺程序；⑤生物残体中损失的有机溶剂过多。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种直接从湿的生物质中提取聚羟基烷酸酯的方法。 本专利技术的一个目的是提供一种得到高纯度的聚羟基烷酸酯的方法。 上述方法较好地解决了现有提取聚羟基烷酸酯方法中存在的不足。 实现本专利技术的方法是提取聚羟基烷酸酯的方法，主要用于含有聚羟基烷酸酯的细胞发酵液，其方法包括取菌体发酵液，经离心后去除上清液，使之干菌体含量在5～50％；用适量有机溶剂溶解菌体中的高分子，并对之搅拌，其搅拌时间不超过45分钟；分离去除残渣，保留溶有聚羟基烷酸酯的有机相；将溶有PHAs的有机相浓缩，即可得到PHAs产品，有机溶剂回收循环利用；发酵液的pH值为4～12；其中聚羟基酯肪酸酯具有以下结构 这里，R1、R2为H、CH3、C2H5、C3H7……但R1≠R2；m、n为正整数；x、y为正整数。 提取方式可采用多次提取(即提取了一次的菌体按上述操作步骤再重复提取两次，第三次分离的有机相作为下一次新鲜菌体的溶剂)或者多级提取(即使用Podbielniak提取)，可以得到较高提取收率。 提取聚羟基烷酸酯的方法用非溶剂处理溶有PHAs的有机相，沉淀即为PHAs，溶剂及非溶剂分离循环利用。 提取高纯度聚羟基烷酸酯的方法所得PHAs用极性非溶剂处理，过滤，晾干或烘干即可得到高纯度PHAs产品；极性非溶剂可回收循环利用。 上述方法还包括所述发酵液包含但不限于P3HB4HB、PHBV、PHBH等聚羟基烷酸酯，其菌体浓度为1％～20％；其高分子含量占细胞干重为40％～85％。 所述有机溶剂应选择其在水中溶解度低的物质，其沸点为50～200℃；有机溶剂优选为酮直链或支链或环酮；酯乙酸甲酯或乙酸乙酯或乙酸丁酯或乙二醇二乙酸酯或碳酸二乙基酯或碳酸二甲基酯或丙酸丁基酯或丁酸乙酯或丁酸丙酯或琥珀酸二甲基酯或β-丁内酯或γ-丁内酯。 所述非溶剂优选为甲醇或乙醇或丙醇或正己烷或异己烷或石油醚。 所述极性非溶剂优选为甲醇或乙醇或丙醇。 所述有机溶剂溶解菌体，其高分子占有机溶剂的浓度为1％～10％。 所述非溶剂用量占总溶剂量20％～80％。 所述极性非溶剂用量为极性非溶剂体积与聚羟基烷酸酯体积之比是1∶1到5∶1。 所述pH值最合适为6～8。 本专利技术的有益效果是湿菌体提取，方法简单，不需对细胞进行干燥处理，操作条件温和；操作步骤少，能耗大大降低，收率提高，减少了生产设备投资，缩短了生产时间；效率高，提取搅拌时间短，分离效果好，选用普通低速离心机即可很好的分离；高分子纯度高，PHAs纯度达到99.0％以上；所需有机溶剂和非溶剂价格便宜，且可回收循环利用。 附图说明 图1表示的是本专利技术一个实施方案的工艺流程框图，包括从湿菌体中PHAs的多级提取、随后的溶剂、极性非溶剂洗提。 图2表示的是本专利技术一个实施方案的工艺流程框图，包括从湿菌体中PHAs的多级提取、随后的溶剂、非溶剂、极性非溶剂洗提。 具体实施方式 下面结合附图和实施例对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从湿菌体中提取高纯度ＰＨＡｓ（聚羟基烷酸酯）的方法，主要用于含有ＰＨＡｓ（聚羟基烷酸酯）的细胞发酵液，其特征是所述方法包括ａ．取菌体发酵液，浓缩去除部分上清液，使之菌体含量在５～５０％；ｂ．用适量有机溶剂溶解菌体中的高分 子，并对之搅拌，其搅拌时间不超过４５分钟；ｃ．分离去除残渣，保留溶有ＰＨＡｓ（聚羟基烷酸酯）的有机相；ｄ．将溶有ＰＨＡｓ（聚羟基烷酸酯）的有机相浓缩，即可得到ＰＨＡｓ（聚羟基烷酸酯）产品，有机溶剂回收循环利用；ｅ．发 酵液的ＰＨ值范围为４～１２；其中ＰＨＡｓ（聚羟基烷酸酯）具有以下结构：＊＊＊这里，Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］为Ｈ、ＣＨ↓［３］、Ｃ↓［２］Ｈ↓［５］、Ｃ↓［３］Ｈ↓［７］……但Ｒ↓［１］≠Ｒ↓［２］；ｍ、ｎ为正整 数；ｘ、ｙ为正整数。

【技术特征摘要】
1.一种从湿菌体中提取高纯度PHAs(聚羟基烷酸酯)的方法，主要用于含有PHAs(聚羟基烷酸酯)的细胞发酵液，其特征是所述方法包括a.取菌体发酵液，浓缩去除部分上清液，使之菌体含量在5～50％；b.用适量有机溶剂溶解菌体中的高分子，并对之搅拌，其搅拌时间不超过45分钟；c.分离去除残渣，保留溶有PHAs(聚羟基烷酸酯)的有机相；d.将溶有PHAs(聚羟基烷酸酯)的有机相浓缩，即可得到PHAs(聚羟基烷酸酯)产品，有机溶剂回收循环利用；e.发酵液的PH值范围为4～12；其中PHAs(聚羟基烷酸酯)具有以下结构 这里，R1、R2为H、CH3、C2H5、C3H7……但R1≠R2；m、n为正整数；x、y为正整数。2.如权利要求1所述的从湿菌体中提取高纯度PHAs(聚羟基烷酸酯)的方法，其特征是用非溶剂处理溶有PHAs(聚羟基烷酸酯)的有机相，沉淀即为PHAs(聚羟基烷酸酯)，溶剂及非溶剂分离循环利用。3.如权利要求1所述的从湿菌体中提取高纯度PHAs(聚羟基烷酸酯)的方法，其特征是所得PHAs(聚羟基烷酸酯)用极性非溶剂处理，过滤，晾干或烘干即可得到高纯度PHAs(聚羟基烷酸酯)产品；极性非溶剂可回收循环利用。4.如权利要求1所述的分离溶有PHAs(聚羟基烷酸酯)的有机相与菌体残渣的方式可以为多次分离，如使用碟式离心机；也可以为多级分离，如使用Podbielniak。5.如权利要求1所述的从湿菌体...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏帮富，
申请(专利权)人：深圳市奥贝尔科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]