一种金钗石斛种苗的组培方法技术

本专利公开了一种金钗石斛种苗的组培方法，建立间歇浸没液体培养系统的系列步骤：步骤一MS培养液的配置与灭菌消毒：MS培养液的组分及组分用量为：MS、NAA0.5～5.0mg/L、马铃薯汁液50～200g/L、蔗糖30g/L，调节pH值为5.70～6.00，配置完成后，放入试剂瓶中，然后将试剂瓶转移至湿热高压灭菌锅内，采用湿热灭菌法进行灭菌后备用；步骤二利用湿热灭菌法对间歇浸没式生物反应器进行灭菌；步骤三、将外植体接种到含有MS培养液的间歇浸没式生物反应器中；步骤四、设定间歇浸没式生物反应器的相关参数。使用该发明专利技术技术方案繁殖金钗石斛种苗，具有增殖率高、自动化程度高、劳动量小、组培苗质量好、适应性强的有益技术效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药用植物组织培养
，具体涉及一种金钗石斛种苗组织培育繁 殖的方法。
技术介绍
金钗石斛为兰科多年生草本植物，别名为扁金钗、扁黄草、扁草、黄草等。金钗石斛 种子微小，胚发育不完全，在自然条件下极难出芽;若以分株或腋芽繁殖，耗时长且繁殖系 数低，金钗石斛赖以生存的自然环境发生变化，野生资源锐减，加之长期采挖，种质资源稀 缺，已濒临灭绝，已不能满足市场需求。 应用植物组织培育方法在一定程度上解决了金钗石斛种苗短缺的现象，有关金钗 石斛的快速繁殖技术国内多有报道。然而，以琼脂为支持物进行固体或半固体培养的传统 植物组织培养方法已日益凸显出不能适应产业呼吁低耗、高效的现实和发展需要。传统的 组培方法培养基的营养成分单一，培养需要耗费大量琼脂，在灌装以及清洗时需处理大量 容器，也需耗费大量劳动力，具有高人工成本、高能耗、高物料的缺点。同时，金钗石斛种苗 的传统组培方法，一般一瓶最多能生长30株，产量少，移栽时需手工轻柔清洗掉根部的固体 培养基，工作量大且容易损伤幼嫩根;在提取有效的次生代谢产物时，必须从琼脂中提取， 工作量大。这些不利因素限制了传统组培技术的产业化利用，亟需对现有的主流组培方法 和装置进行节约型、自动化的技术升级。
技术实现思路
本专利技术针对上述存在的技术问题，提供一种繁殖迅速、周期短、种苗产量高；自动 化程度高的金钗石斛种苗方法。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供，建立间歇浸 没液体培养系统，包括以下步骤： 步骤一、MS培养液的配置与灭菌消毒： MS培养液的组分及组分用量为:MS、NAA0.5~5. Omg/L、马铃薯汁液50~200g/L和蔗糖 30g/L，调节pH值为5.70~6.00，MS培养液配置完成后，放入试剂瓶中，然后将试剂瓶转移至 湿热高压灭菌锅内，进行加热加压灭菌，加热温度为121°C，压力为0.1~l.OMPa，灭菌20min 后备用；间歇浸没式生物反应器的灭菌：取间歇浸没式生物反应器在湿热高压灭菌锅内进 行加热加压灭菌，加热温度为121°C，压力为0.1~l.OMPa，灭菌20min后备用； 步骤二、制备金钗石斛外植体； 步骤三、接种:在无菌环境下将步骤一的MS培养液倒入间歇浸没式生物反应器中，然后 将金钗石斛外植体接种到间歇浸没式生物反应器中； 步骤四、培养:设定间歇浸没式生物反应器的相关参数，即：浸没频率为3~20min/4~ 12h，培养时间为60~180d;设定培养环境条件为:光照强度1500~1800Lx，光照12h/d，温度 为 25±1。(3。 本专利技术的有益效果为:步骤一增殖率高。本专利技术技术方案将制得的MS培养液消毒 后倒入间歇浸没式生物反应器中，建立了间歇浸没液体培养系统，在无菌条件下利用无菌 空气产生的压力将MS培养液与外植体间歇接触，结合了固体培养最大化气体交换和液体培 养营养充分利用的优点，本专利技术方案金钗石斛培养的增殖率是传统的固体培养的10倍以 上，是普通液体培养的3~7倍。 步骤二自动化程度高、劳动量小。间歇浸没液体培养系统实现了半自动化控制，整 个培养过程只需要一次接种，同一间歇浸没式生物反应器中仅需更换一次MS培养液，省去 了现有技术中频繁转接和大批量组培瓶的灌装清洗等的操作，大大的减少了劳动量，降低 了生产成本。 步骤三、组培苗质量好，适应性强。同传统的固体培养基相比减少了继代次数，降 低了变异率，并且在培养过程中进行了充分的气体交换，减少甚至避免了种苗玻璃化，繁殖 得到的种苗更健壮;种苗环境适应能力强、移栽成活率高。 进一步，步骤二所述金钗石斛外植体为金钗石斛原球茎、金钗石斛组培苗中的一 种。 进一步，步骤二金钗石斛外植体还可为金钗石斛腋芽，所述金钗石斛腋芽的制备 方法为:第一步：制备MS固体培养基:MS、NAA0 · 5~5 · Omg/L、马铃薯汁液50~200g/L、蔗糖 30g/L、琼脂7g/L;混合配置后备用；第二步:采用金钗石斛植株，用浓度为0.1~1.0%的新洁 尔灭溶液浸泡金钗石斛植株5~30min，然后用流动的水清洗30~60min;在无菌环境中，去 除清洗后的金钗石斛植株的叶片，并用75%的酒精浸泡15~30s，用无菌水清洗2次，再用浓 度〇. 1%的升汞浸泡10~20min，最后再用无菌水清洗3~7次;第三步:将完成了第二步的金 钗石斛植株切成若干茎段，每个茎段含有一个腋芽，将茎段接种到MS固体培养基中，3~5d 后取出，制得腋芽并接种到步骤三的间歇浸没式生物反应器中。进一步，步骤三中外植体的接种密度为:每升MS培养液中接种35~80个外植体。通 过实验证实，当每升MS培养液中外植体接种量低于35个时，外植体没有充满整个间歇浸没 式生物反应器反应器，空间利用率低，当每升MS培养液中外植体接种量高于80个时，间歇浸 没式生物反应器中的外植体拥挤，出现畸形苗;每升MS培养液中接种35~80个外植体时，既 能充分利用间歇浸没式生物反应器的空间及MS培养液中的营养，有不会导致外植体拥挤出 现畸形苗的情况。 进一步，步骤一中马铃薯汁液为马铃薯研磨或榨汁方式制得。鲜物研磨、煎煮汁或 榨汁获得马铃薯汁液既能满足破坏组织和细胞获得细胞内含物的目的，又不会破坏细胞内 大分子结构。 进一步，步骤四中所述浸没频率为5~12min/8~10h。此浸没频率在最大限度节约 能源消耗的基础上，既能够满足金钗石斛对营养的需求，又不会因营养过剩而出现缺氧、徒 长等不健康生长等现象。【附图说明】 图1为本专利技术实施例3接种时的初始状态图； 图2为对比例1接种时的初始状态图； 图3为本专利技术实施例3培养2周后的金钗石斛种苗的生长 状态图； 图4为对比例1培养2周后的金钗石斛种苗的生长状态图。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术技术方案作进一步说明： 实施例1: ，建立间歇式浸没液体培养系统，包括以下步 骤： 步骤一、制备马铃薯汁液:选择完好无腐烂的马铃薯块茎，研磨或压碎榨汁，过滤取汁 液，备用； 步骤二、MS培养液的配置与灭菌消毒： MS培养液的组分及组分用量为:MS、NAA1.0mg/L、马铃薯汁液50g/L、蔗糖30g/L和琼脂 7g/L，调节pH值在5.70~6.00范围内，配置完成后，将MS培养液倒入试剂瓶中，然后将试剂 瓶转移至湿热高压灭菌锅内，进行加热加压灭菌，加热温度为121°C，压力为0.1~l.OMPa， 灭囷20min后备用； 步骤三、间歇浸没式生物反应器的灭菌:利用湿热灭菌法，将间歇浸没式生物反应器放 入湿热高压灭菌锅内，在温度121°C、压力l.OMPa条件下对间歇浸没式生物反应器进行灭菌 20min后备用； 步骤四、金钗石斛腋芽的制备： 第一步:制备MS固体培养基:MS固体培养基的组分及组分用量为:MS、NAA1. Omg/L、马铃 薯汁液50g/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L;调节pH值为5.70~6.00范围内，静置，备用； 第二步:采用金钗石斛植株，用浓度为0.1%的新洁尔灭溶液浸泡金钗石斛植株30min， 然后用流动的水清洗60min;在无菌环境中，去除清洗后的金钗石斛植株的叶片，并用75%的 酒精浸泡30s，用无菌水清洗2次，再用浓度0.1%的升汞浸泡20min，最后再用无菌水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金钗石斛种苗的组培方法，其特征在于：建立间歇浸没液体培养系统，包括以下步骤：步骤一、MS培养液的配置与灭菌消毒：MS培养液的组分及组分用量为：MS、NAA0.5～5.0mg/L、马铃薯汁液50～200g/L和蔗糖30g/L，调节pH值为5.70～6.00，MS培养液配置完成后，放入试剂瓶中，然后将试剂瓶转移至湿热高压灭菌锅内，进行加热加压灭菌，加热温度为121℃，压力为0.1～1.0MPa，灭菌20min后备用；间歇浸没式生物反应器的灭菌：取间歇浸没式生物反应器在湿热高压灭菌锅内进行加热加压灭菌，加热温度为121℃，压力为0.1～1.0MPa，灭菌20min后备用；步骤二、制备金钗石斛外植体；步骤三、接种：在无菌环境下将步骤一制得的MS培养液倒入间歇浸没式生物反应器中，然后将金钗石斛外植体接种到间歇浸没式生物反应器中；步骤四、培养：设定间歇浸没式生物反应器的相关参数，即：浸没频率为3～20min/4～12h，培养时间为60～180d；设定培养环境条件为：光照强度1500～1800Lx，光照12h/d，温度为25±1℃。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐德林，李林，陈集双，李晓飞，张本厚，储士润，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52