一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法，是以绒毛白蜡成熟种子胚的胚根为外植体，在MS盐分+B5有机+2mg·L–16-苄基腺嘌呤(BA)+0.1mg·L–1萘乙酸(NAA)+30g·L–1glucose+5.0g·L–1agar的诱导培养基和MS盐分+B5有机+30g·L–1glucose+5.0g·L–1agar萌发培养基上诱导出体细胞胚并获得再生植株。实验证实体胚诱导率为59.8％，体胚萌发率高达81.2％，本发明专利技术方法为绒毛白蜡转基因育种工程、优良无性系工厂化育苗和种质资源保护等提供和建立了成熟稳定的技术体系。

【技术实现步骤摘要】
一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法
本专利技术属于白蜡属组织培养繁育
，特别涉及一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法。
技术介绍
绒毛白蜡(FraxinusvelutinaTorr.)为木犀科(oleaceae)白蜡属(Fraxinus)落叶乔木，根系发达，耐盐碱，抗逆性强，适应范围广，是开发利用盐碱地的先锋树种。全世界已有白蜡属植物70余种，我国30余种，全国各省各地区均有栽植。近年来，国内有关绒毛白蜡的繁殖主要以播种育苗为主，播种育苗培育出的苗木长势不好、参差不齐、且随着育苗繁殖代数的增加，产生了变异，白蜡良种潜力尚未能得到充分利用，使得白蜡优良种质的供应无法满足市场的需求。对于大多数植物来说，体细胞胚诱导是组织培养方法中最好的无性繁育技术(Merkleetal.，2005；Ohetal.，2010；胡峰等，2014)，具有高度的遗传稳定性，能保持无性系母本的优良性状，有利于白蜡优良无性系苗木的大规模化生产(Arnoldetal.，2002)，也可用于人工种子生产，在种质资源繁殖方面应用前景广泛。因此，通过体细胞胚诱导途径建立绒毛白蜡组织培养繁育技术体系具有非常重要的应用价值。近年来，关于白蜡属植物通过器官发生途径和腋芽增殖途径获得再生植株的研究较多，而通过体胚发生途径再生植株的报道相对较少。目前，关于白蜡属植物腋芽增殖和器官发生途径获得的再生植株的报道多集中在美国白蜡(F.americana)(Preeceetal.，1991)、欧洲白蜡(F.excelsior)(Hammatt1994,1996；Tabtettetal.，1992；Silveiraetal.，1994)、细叶白蜡(F.angustifolia)(Tononetal.，2000)、对节白蜡(F.hupehensis)(王彩云等，1999)、红梣(F.pennsylvanicaMarsh.)(Kimetal.，1997)、绒毛白蜡(F.velutinaTorr.)(陈之群等，2006；王磊等，2008)、常青白蜡(F.griffithii)(李素华等，2009)、大叶白蜡(F.americana)(洪源范等，2006)等。近几年也有对白蜡属植株体胚发生进行研究的报道，如已从水曲柳(F.mandshurica)(孔冬梅等，2006)、美国白蜡(F.americana)(Batesetal.,1992)、细叶白蜡(F.angustifolia)(Tononetal,2001)、欧洲白蜡(F.excelsior)(Capuanaetal.，2007)和花曲柳(F.rhynchophylla)(杨玲等，2012)成功诱导体细胞胚并获得白蜡再生植株。但关于绒毛白蜡无性繁育组织培养技术的研究报道极少，陈之群等(2006)以绒毛白蜡茎段为外植体，通过腋芽增殖途径获得再生植株；王磊等(2008)以绒毛白蜡成熟胚和茎段为外植体，研究了其组织培养和植株再生技术，平均增殖系数为3.59，存在繁育增殖率低及生根率低等缺陷。迄今为止，有关植物组织培养技术的各类文献中，尚未见有关绒毛白蜡体胚发生和植株再生技术的研究报道。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法。本专利技术的通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法，步骤是：(1)选取颗粒饱满的种子剥除外种皮后置于三角瓶中，流水冲洗2–3小时，用75％乙醇浸泡1分钟，再用0.1％的升汞消毒8–10分钟，无菌水冲洗4–5次后，将消毒后的种子在超净工作台上接种到MS种子萌发培养基上，萌发2–6天；(2)取萌发的胚根为外植体，接种在体细胞胚诱导培养基上，暗培养后，获得胚性愈伤组织；(3)将暗培养后的胚性愈伤组织转移到体胚萌发培养基上，进行光照培养，诱导出体胚苗；(4)将体胚苗转移到试管苗复壮培养基，光照培养10–14天后，转入生根培养基继续光照培养；(5)将步骤(4)获得的生根植株炼苗，移栽；其特征在于：步骤(2)中所述的体细胞胚诱导培养基配方为：MS盐分+B5有机+1.8–2.2mg·L–16-苄基腺嘌呤(BA)+0.08–0.12mg·L–1萘乙酸(NAA)+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.2–5.4；步骤(3)中所述的体胚萌发培养基为MS盐分+B5有机+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.7–5.9，优选pH值5.8；其中，上述MS盐分+B5有机的组分为：KNO31900mg·L-1，NH4NO31650mg·L-1，MgSO4·7H2O370mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，CaCl2·2H20440mg·L-1，MnSO4·4H2O22.3mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，H3BO36.2mg·L-1，KI0.83mg·L-1，NaMoO4·2H2O0.25mg·L-1，CuSO4·5H2O0.025mg·L-1，CoCl2·6H2O0.025mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，FeSO4·7H2027.8mg·L-1，维生素B110mg·L-1，维生素B61mg·L-1，叶酸0.5mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1；上述暗培养是指在培养瓶上覆盖黑布，于昼温度25±2℃，夜温度18±2℃条件下，培养18–22天；上述种子萌发、体胚诱导培养、体胚萌发培养、试管苗复壮、生根培养各阶段光照培养的条件为：14小时光照/10小时黑暗，光密度为100–120μmol·m-2·s-1。上述通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法中：步骤(2)所述取萌发的胚根优选为萌发3天的胚根。上述通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法中：步骤(2)所述的体细胞胚诱导培养基配方优选为：MS盐分+B5有机+2.0mg·L–16-苄基腺嘌呤(BA)+0.1mg·L–1萘乙酸(NAA)+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.4。上述通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法中：步骤(2)所述的暗培养优选是于昼温度25±2℃，夜温度18±2℃条件下，培养20天。上述通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法中：步骤(4)中所述试管苗复壮培养基配方为：WPM培养基+0.5mg·L–16-BA+0.2mg·L–1ZT+0.01mg·L–1NAA+30mg·L–1葡萄糖(glucose)+5.0g·L–1琼脂(agar)，pH值5.8。上述通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法中：步骤(4)中所述生根培养基配方为：1/2MS培养基+1.0mg·L–1IBA+0.05mg·L–1NAA+20mg·L–1葡萄糖(glucose)+5.0g·L–1琼脂(agar)，pH值5.8。上述通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法中：步骤(5)所述将步骤(4)获得的生根植株炼苗，移栽的方法是：挑选株高1.5–3cm以上、叶片展开、根系发达的瓶苗转移到炼苗温室中适应1–2天，然后用清水逐棵洗净根部附着的培养基，并将其移栽到含有轻型基质(沙:土:草炭体积比为4:1:2)的无纺布营养杯中，放置于遮光度60％–70％遮荫网塑料大棚内，利用自动间歇喷雾装置保持棚内空气相对湿度在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法，步骤是：(1)选取颗粒饱满的种子剥除外种皮后置于三角瓶中，流水冲洗2–3小时，用75％乙醇浸泡1分钟，再用0.1％的升汞消毒8–10分钟，无菌水冲洗4–5次后，将消毒后的种子在超净工作台上接种到MS种子萌发培养基上，萌发2–6天；(2)取萌发的胚根为外植体，接种在体细胞胚诱导培养基上，暗培养后，获得胚性愈伤组织；(3)将暗培养后的胚性愈伤组织转移到体胚萌发培养基上，进行光照培养，诱导出体胚苗；(4)将体胚苗转移到试管苗复壮培养基，光照培养10–14天后，转入生根培养基继续光照培养；(5)将步骤(4)获得的生根植株炼苗，移栽；其特征在于：步骤(2)中所述的体细胞胚诱导培养基配方为：MS盐分+B5有机+1.8–2.2mg·L–16‑苄基腺嘌呤(BA)+0.08–0.12mg·L–1萘乙酸(NAA)+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.2–5.4；步骤(3)中所述的体胚萌发培养基为MS盐分+B5有机+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.7–5.9；其中，上述MS盐分+B5有机的组分为：KNO3 1900mg·L‑1，NH4NO3 1650mg·L‑1，MgSO4·7H2O 370mg·L‑1，KH2PO4 170mg·L‑1，CaCl2·2H20 440mg·L‑1，MnSO4·4H2O 22.3mg·L‑1，ZnSO4·7H2O 8.6mg·L‑1，H3BO3 6.2mg·L‑1，KI 0.83mg·L‑1，NaMoO4·2H2O 0.25mg·L‑1，CuSO4·5H2O 0.025mg·L‑1，CoCl2·6H2O 0.025mg·L‑1，Na2‑EDTA 37.3mg·L‑1，FeSO4·7H20 27.8mg·L‑1，维生素B1 10mg·L‑1，维生素B61mg·L‑1，叶酸0.5mg·L‑1，肌醇100mg·L‑1，甘氨酸2.0mg·L‑1；上述暗培养是指在培养瓶上覆盖黑布，于昼温度25±2℃，夜温度18±2℃条件下，培养18–22天；上述种子萌发、体胚诱导培养、体胚萌发培养、试管苗复壮、生根培养各阶段光照培养的条件为：14小时光照/10小时黑暗，光密度为100–120μmol·m‑2·s‑1。...

【技术特征摘要】
1.一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法，步骤是：(1)选取颗粒饱满的种子剥除外种皮后置于三角瓶中，流水冲洗2–3小时，用75％乙醇浸泡1分钟，再用0.1％的升汞消毒8–10分钟，无菌水冲洗4–5次后，将消毒后的种子在超净工作台上接种到MS种子萌发培养基上，萌发2–6天；(2)取萌发的胚根为外植体，接种在体细胞胚诱导培养基上，暗培养后，获得胚性愈伤组织；其中：所述暗培养是指在培养瓶上覆盖黑布，于昼温度25±2℃，夜温度18±2℃条件下，培养18–22天；(3)将暗培养后的胚性愈伤组织转移到体胚萌发培养基上，进行光照培养，诱导出体胚苗；(4)将体胚苗转移到试管苗复壮培养基，光照培养10–14天后，转入生根培养基继续光照培养；(5)将步骤(4)获得的生根植株炼苗，移栽；上述种子萌发、体胚诱导培养、体胚萌发培养、试管苗复壮、生根培养各阶段光照培养的条件为：14小时光照/10小时黑暗，光密度为100–120μmol·m-2·s-1；其特征在于：步骤(2)中所述的体细胞胚诱导培养基配方为：MS盐分+B5有机+1.8–2.2mg·L–16-苄基腺嘌呤(BA)+0.08–0.12mg·L–1萘乙酸(NAA)+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.2–5.4；步骤(3)中所述的体胚萌发培养基为MS盐分+B5有机+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.7–5.9；其中，上述MS盐分+B5有机的组分为：KNO31900mg·L-1，NH4NO31650m...

【专利技术属性】
技术研发人员：燕丽萍，刘翠兰，吴德军，李丽，王开芳，藏真荣，
申请(专利权)人：山东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37