本发明专利技术公开了一种绒毛白蜡耐盐碱SCAR标记，该SCAR标记是全长592bp的特异片段S20-592，其核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术的SCAR标记可广泛用于耐盐碱绒毛白蜡分子标记的辅助选择育种，同时为克隆绒毛白蜡耐盐碱基因、基因序列分析奠定了良好的基础。本发明专利技术可实现对个体进行苗期鉴定，大大提高了育种效率，缩短了育种进程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种SCAR标记及其应用，尤其涉及一种耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记及其在辅助选择育种中的应用，属于生物
技术介绍
白蜡属全世界约70余种，大多数分布在北半球暖温带，中国已有34种，其中原产 26种，国外引进8种。续毛白腊(Fraxinus VelutinaTorr.)为木庫科(Oleaceae)白腊属 (Fraxinus Linn.)落叶乔木,原产为美国，生长快,树干通直,木质结构均勻，纹理美观,易繁殖、抗逆，是优良盐碱地造林、园林绿化和珍贵的用材树种。早在1911年引种到济南(孟昭和等，2001)，1953年被转引到天津(杨瑞兴等，1996)，80年代后在华北华东地区广泛栽培。目前已成为我国华北、华东主要沿海城市及盐碱地区造林和园林绿化优良树种(时明芝，1996 ;王勤等，2000 ;倪国祥等，1995 ;王友平等，2007)。国内关于白蜡生态特性、生长习性方面的研究较多，主要侧重于白蜡的耐盐碱性、 苗木繁育、造林技术等方面。樊宝敏(1992)报道，绒毛白蜡对呈碱性反应的滨海盐土较为敏感；孟康敏(1999)对5个滨海盐碱地引种的树种幼苗进行盆栽耐盐性试验，根据光合速率、叶绿素含量、细胞膜透性、丙二醛含量、游离脯氨酸含量等5个耐盐性生理指标进行综合评判，结果表明绒毛白蜡耐盐力最强；刘德玺等(2008)以盐溃生境下1-3年生红涔为材料，对不同树龄红涔的各营养器官中盐离子分布规律进行了研究；王友平等(2009)研究了盐溃生境下1-3年生绒毛白蜡不同营养器官中盐离子分布规律。近年来国外报导多集中在欧洲白腊(F. excelsior)的核DNA微卫星、叶绿体微卫星标记、EST-SST标记筛选分离，以及微卫星标记在种群遗传分析与系统发生生物地理学研究上。Heurtz等(2004)通过对全欧洲野生F. excelsior群体的叶绿体DNA与叶绿体微卫星分析认为,较低的单倍体多态是由于风媒植物的基因流影响。Bacles等(2008)利用微卫星标记进行了大尺度景观下苏格兰 F. excelsior群体的花粉基因流的父本分析，花粉基因流的交换取决于群体大小，而不是地理位置。Goto等(2006)利用5个微卫星位点对日本北部滨海森林的F. mandshurica var. japonica的亲本与后代的基因型分析，结果表明小范围内亲本的个体分析可以为风媒植物提供定量的分析。对绒毛白腊(F. Velutina)的相关DNA标记序列未能在GenBank上检索到，遗传学基础研究十分薄弱，遗传背景信息匮乏，这在很大程度上限制了选择育种工作的顺利开展。因此开展相应的遗传学基础研究、定位重要经济性状是我国白蜡选育工作中首先需要解决的问题。此外，传统的白蜡分类主要依靠果实形状和果翅数目的不同，该分类方法无法有效的在幼树早期进行应用。因此利用分子生物学办法、建立有效、快捷的种质鉴别方法对解决我国白蜡树良种选育具有重要的意义。分子标记辅助选择育种是一种新型的育种方式，应用分子标记辅助选择育种，可有效的检测基因型，进行QTL定位，直接通过标记基因辅助选择含有目标基因型的个体。与传统的育种方法相比，分子标记辅助选择育种方法，直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；中性标记，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁共显性标记，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。RFLP标记、AFLP标记操作较为繁琐，而RAPD标记准确性和稳定性较差，均不适合于大规模的田间材料的鉴定工作；SCAR标记操作简便、准确性高、稳定性高克服了上述标记的缺点，为首选的分子标记方法。由于林木育种周期长，要改变在绒毛白蜡育种领域上的落后局面，关键在于尽快广泛收集品种资源，走现代分子生物学技术与常规育种相结合的道路，缩短育种年限，加快分子标记辅助选择利用的研究。因此，获得耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记，对于绒毛白蜡良种选育具有重要的意义，为我国耐盐碱林木种质的选育研究提供理论基础和技术体系；丰富耐盐碱绿化树种的遗传多样性，扼制土地盐溃化，提高土地生产力；增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记及其在用于辅助选择育种中的应用。本专利技术所述的耐盐碱绒毛白蜡SCAR标记，其特征在于，该SCAR标记是全长592bp 的特异片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示。为实现上述任务，本专利技术采取如下步骤的技术方案(I)、以2株高耐盐型绒毛白蜡分别为R36、R39和5株普通绒毛白蜡为材料；(2)、采用CTAB法提取绒毛白蜡叶片总DNA ；(3)、建立并优化绒毛白蜡RAPD反应体系，获得稳定高效的RAPD扩增结果；(4)、应用RAPD 分析筛选出一个与耐盐碱相关联的分子标记S20-592 ； (5)、将耐盐碱基因的RAPD分子标记 S20-592克隆、测序并转化为SCAR标记。其中步骤(I)所述的高耐盐型绒毛白蜡R36、R39是山东省林业科学研究院刘德玺通过 20年的选育获得。步骤⑵所述的采用CTAB法提取绒毛白蜡叶片总DNA的具体方法是1)取0. I 0.2g绒毛白蜡叶片，于液氮中研磨。加入800 ill DNA提取缓冲液含有2% (w/v)CTAB, 20mmol/LEDTA(pH = 8. 0) UOOmmoI/L Tris-HCl (pH = 8. 0),1. 4mol/LNaCl 和 2% @ -巯基乙酉享，轻轻颠倒混勻；2)于65°C水浴中温育30min,每IOmin颠倒轻轻混勻，12000rpm,离心 IOmin ;3)取上清700 ii L,加入等体积氯仿/异戍醇(24 I, v v),轻轻颠倒混勻,4°C, 12000rpm,离心IOmin ;4)取上清600ii I,加入等体积氯仿/异戍醇(24 : I, v : v),轻轻颠倒混匀，4°C，12000rpm,离心IOmin ；5)取上清500 U 1，加入2倍体积的冰冷的无水乙醇， 颠倒混匀，-20°C静置30min ;6) 4°C，12000rpm，离心IOmin ；7)去上清，用预冷的75%乙醇洗漆沉淀2次，4°C, IOOOOrpm,离心5min ；8)在超净工作台干燥沉淀30min,加30 y I的灭菌蒸水(ddH20)溶解沉淀，待浓度和纯度检测后，置_20°C或_70°C冰箱保存备用。步骤(3)所述的RAPD扩增的具体方法是PCR反应总体积25 yl，IOX反应缓冲液 2. l，25mM/L MgCl2 I. 8u 1,10mM/L dNTPs I. 5 y 1，30ng/y I 引物 P 2 yl，模板 DNA 2u l，2u/ul TaqDNA 聚合酶 0. 25 ii 1，ddH20 14. 95 u I ;PCR 反应条件95 °C 预变性 5min， 94°C变性 30s, 36°C退火 lmin,72°C延伸 2min,循环 44 次,72°C延伸 IOmin0 电泳 Marker 和试剂为TAKARA公司生产，扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：燕丽萍，夏阳，刘翠兰，李双云，李丽，
申请(专利权)人：山东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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