一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法技术

本发明专利技术公开了一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法。本发明专利技术首先提取待测小麦样品的DNA；以上述的DNA作为模板，采用多重荧光标记SSR引物(Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398)进行多重PCR扩增；PCR产物毛细管电泳检测；收集荧光信号进行数据分析，根据多重荧光标记SSR引物的扩增片段大小及其主峰，来判定待测小麦的3B、4B、5A和6B位点上是否含有赤霉病抗性分子标记。本发明专利技术首次将多重SSR荧光标记检测技术应用于小麦抗赤霉病的检测，可在一个反应中同时检测小麦不同染色体上的四个聚合位点，对选育具有赤霉病持久抗性和综合抗性的材料或小麦品种具有重要的意义。

Multiple fluorescence SSR labeling method for detection of wheat scab resistance

The invention discloses a multi fluorescent SSR labeling method for detection of wheat scab resistance. The invention firstly extracted wheat samples to be measured by the DNA; the DNA as a template, using multiple fluorescent SSR primers (Xgwm533, GWM495, BARC117 and WMC398) were amplified by multiplex PCR PCR products; capillary electrophoresis; data collection analysis of fluorescence signal, according to multiple fluorescent SSR primers amplified fragment size and peak. To determine the measured wheat 3B, 4B, 5A and 6B loci containing scab resistance marker. The invention for the first time detected by multiplex SSR fluorescence detection technique to wheat scab resistance, which can simultaneously detect four different polymerization sites on the chromosomes of wheat in a reaction, has important significance to scab resistance and resistance breeding of durable materials or wheat varieties.

【技术实现步骤摘要】
一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法
本专利技术涉及小麦病害的检测新
，具体是针对多个小麦抗赤霉病分子标记开发的多重SSR荧光标记检测新技术。
技术介绍
小麦赤霉病(Fusariumheadblight，FHB)主要由真菌禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchwabe)引起的小麦穗部侵染病害，现已成为全球性的小麦病害，被称为小麦病害的癌症，常发病在长江中下游冬麦区、川滇冬麦区和华南冬麦区等地区。由于近几年全球气候变暖、多雨湿润，导致该病害呈由南向北扩展趋势，发病严重时可导致小麦减产达80％-90％，其中真菌脱氧雪腐镰刀菌稀醇(DON)和赤霉烯酮(ZEN)毒素的污染不仅影响小麦品质生产、人畜健康，而且还会严重威胁我国小麦粮食生产和安全。采用传统的育种技术进行抗赤霉病小麦品种选育，存在田间鉴定困难、费时费力、结果不可靠、鉴定标准不统一等问题。因而将分子标记鉴定技术与传统育种技术相结合，通过选育具有赤霉病持久抗性和综合抗性的材料或品种是减轻小麦赤霉病危害的有效手段。目前，利用分子标记进行基因聚合与选育方面的研究引起了大家广泛关注，国内近几年在水稻、小麦、大麦等作物的抗盐碱、抗病虫害多基因聚合研究较多。其中小麦抗赤霉病抗性基因聚合与育种方面的研究已成为热点。在利用分子标记进行基因聚合与选育方面的研究已成为热点的基础上，随之而来的有关抗性检测技术的研究也有较大的进展。其中，与传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳相比较，SSR荧光标记毛细管电泳检测技术因具有高效、准确、自动化等优点，在玉米、水稻、油菜、大麦、黑麦草、烟草、莴苣和竹子等多种植物分子标记研究中显示出极为广阔的应用前景。然而，该技术在小麦中的研究应用目前还停留在单个位点的检测上，存在通量小、时间和试剂成本较高的问题。近些年，SSR荧光标记毛细管电泳检测技术在小麦的研究中也仅限于种子纯度检验、新品种测试、种质资源管理等领域，在小麦赤霉病抗病性的鉴定中还是空白，尤其是多重荧光SSR标记检测技术的研发。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法。本专利技术通过收集已报道的普通小麦染色体3BS(Fhb1)、6BS(Fhb2)、4B(Fhb4)和5AS(Fhb5)上与赤霉病抗性紧密连锁的24对SSR标记特异引物，利用常规PCR筛选出每条染色体上扩增效率高、多态性好的引物，使用不同颜色的荧光染料对其5’末端进行标记，根据扩增片段大小范围、信号强度将引物进行2+2(2个FAM荧光标记位点+2个HEX荧光标记位点)组合，应用ABI3730XL全自动DNA分析仪收集荧光信号，利用GeneMapperv4.0进行数据分析，从而建立可同时检测四个小麦抗赤霉病位点的SSR荧光标记检测体系。该技术与传统的聚丙烯酰胺电泳法相比，具有准确率高、检测通量大、耗时短和数据采集自动化等优势，为小麦赤霉病分子标记辅助选择提供了技术支撑，尤其适用于大规模样本筛选，该项技术的推广利用可以显著缩短小麦抗赤霉病新品种的育成年限，将极大提高育种效率。本专利技术的技术方案是：一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，包括以下步骤：1)提取待测小麦样品的DNA；2)以上述的DNA作为模板，采用多重荧光标记SSR引物进行多重PCR扩增；多重荧光标记SSR引物为Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398，其核苷酸序列依次如表2及序列表SEQIDNo.1～8所示；采用的荧光染料依次为：5'FAM、5'FAM、5'HEX和5'HEX。其中多重PCR扩增反应体系为(15μL)：5×PCRBuffer(含2mmol/LMg2+)3μL、2.5mmol/LdNTP1.2μL、5UTaq酶0.1μL、引物mix1μL，DNA模板1.8μL，超纯水7.9μL。其中引物mix为：4对引物(Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398的正向引物、反向引物，共8条)的浓度均为1μmol/L，总的引物浓度为8μmol/L。PCR反应程序：95℃模板预变性5min，1个循环；95℃模板变性1min，60℃与模板靶位点结合45s，72℃引物延伸45s，共35个循环；最后60℃延伸30min，16℃保存。3)PCR产物毛细管电泳检测PCR产物荧光毛细管电泳检测为：向980μL去离子甲酰胺中加入20μLROX500内标，涡旋混匀，短暂离心，以每孔10μL分装到新的96孔板内，取1μLPCR产物对应的加入各孔中，3000r/min离心1min；PCR仪上95℃变性5min，立即置于冰上5min后，利用ABI3730XLDNA分析仪上进行荧光毛细管电泳检测。4)收集荧光信号进行数据分析，根据多重荧光标记SSR引物Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398的扩增片段大小及其主峰，来判定待测小麦中上述标记分别对应的3B、4B、5A和6B位点上是否含有赤霉病抗性分子标记。优选应用ABI3730XL全自动DNA分析仪收集荧光信号，利用GeneMapperv4.0进行数据分析。本专利技术首次将多重SSR荧光标记检测技术应用于小麦抗赤霉病的检测，可在一个反应中同时检测小麦不同染色体上的四个聚合位点，这表明在小麦抗赤霉病病害的研究中，应用分子标记检测可以有效的节约成本、达到高效、准确的效果，有助于推动不同位点的抗病基因进行有针对性聚合方面的研究工作。该技术与传统的聚丙烯酰胺电泳法相比，具有准确率高、检测通量大、耗时短和数据采集自动化等优势，为小麦赤霉病分子标记辅助选择提供了技术支撑，尤其适用于大规模样本筛选。本专利技术多重SSR荧光标记的四个位点都是主效QTL，其中4B、5AS来自于Ⅰ型抗性(抗侵染)，3BS、6BS来自于Ⅱ型抗性(抗扩展)，将这四个位点的QTL都聚合在一起，对选育具有赤霉病持久抗性和综合抗性的材料或小麦品种具有重要的意义。附图说明图1为抗赤霉病四个位点荧光检测的等位变异峰图；其中第一、二、三、四、五道的椭圆圈为每个等位变异的阳性主峰位置，第六道的椭圆圈为每个等位变异的阴性主峰位置；纵坐标表示荧光信号强度；横坐标表示扩增片段大小(bp)；图2为抗赤霉病单个位点荧光检测的等位变异峰图；其中椭圆圈为每个等位变异的阳性主峰位置；纵坐标表示荧光信号强度；横坐标表示扩增片段大小(bp)；图3为抗赤霉病两个位点荧光检测的等位变异峰图；其中椭圆圈为每个等位变异的阳性主峰位置；纵坐标表示荧光信号强度；横坐标表示扩增片段大小(bp)；图4为抗赤霉病三个位点荧光检测的等位变异峰图；其中椭圆圈为每个等位变异的阳性主峰位置；纵坐标表示荧光信号强度；横坐标表示扩增片段大小(bp)；图5为6个小麦亲本(望水白、NMAS018、NMAS020、NMAS019、济麦22、济麦44)分别采用Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398分子标记引物进行扩增的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图片；图中M：фX174-HincIIdigestDNAmarker；其中，按分子标记区分：1-7泳道引物为GWM495，8-14泳道引物为Xgwm533，15-21泳道引物为WMC398，22-28泳道引物为BARC117；按小麦亲本区分，1、8、15、22泳道为望水白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，包括以下步骤：1)提取待测小麦样品的DNA；2)以上述的DNA作为模板，采用多重荧光标记SSR引物进行多重PCR扩增；多重荧光标记SSR引物为Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398；3)PCR产物毛细管电泳检测；4)收集荧光信号进行数据分析，根据多重荧光标记SSR引物Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398的扩增片段大小及其主峰，来判定待测小麦中Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398分别对应的3B、4B、5A和6B位点上是否含有赤霉病抗性分子标记。

【技术特征摘要】
1.一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，包括以下步骤：1)提取待测小麦样品的DNA；2)以上述的DNA作为模板，采用多重荧光标记SSR引物进行多重PCR扩增；多重荧光标记SSR引物为Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398；3)PCR产物毛细管电泳检测；4)收集荧光信号进行数据分析，根据多重荧光标记SSR引物Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398的扩增片段大小及其主峰，来判定待测小麦中Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398分别对应的3B、4B、5A和6B位点上是否含有赤霉病抗性分子标记。2.如权利要求1所述的一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，所述Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398采用的荧光染料依次为：5'FAM、5'FAM、5'HEX和5'HEX。3.如权利要求2所述的一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，所述步骤2)多重PCR扩增，采用的15μL的多重PCR扩增反应体系为：含2mmol/LMg2+的5×PCRBuffer3μL、2.5mmol/LdNTP1.2μL、5UTaq酶0.1μL、引物mix1μL，DNA模板1.8μL，超纯水7.9μL；其中引物mix为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪燕，梁水美，王灿国，张全芳，李豪圣，刘建军，步迅，范阳阳，刘艳艳，杨连群，胡悦，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东,37