α-乳清蛋白基因构建物制造技术

本发明专利技术提供了重组基因构建物用于在牛细胞中表达α－乳清蛋白，尤其是人α－乳清蛋白。为增强表达α－乳清蛋白，提供了新的基因构建物，载体，转化细胞以及遗传工程化的转基因动物。已证明人α－乳清蛋白对人婴幼儿营养有优越性，本发明专利技术能够廉价有效地在人乳中生产主要乳清蛋白。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组的基因构建物，该构建物可表达α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。人乳相对牛乳、绵羊乳、驼乳、山羊乳等其他类型的乳有更优越的营养价值，有助于人类婴幼儿生长。然而许多母亲认为乳房喂乳困难或不便。在婴幼儿食品需求量极大的国家，也极其需要提供一种有人乳营养价值的乳制品。人乳相对其他哺乳动物(例如牛或绵羊)乳的主要区别之一在于，它含α-乳清蛋白作为主要乳清蛋白。尽管α-乳清蛋白也存在于其他种类的乳中，但其浓度相对较低，主要乳清蛋白为β-乳球蛋白。α-乳清蛋白水平在种与种之间不同，人乳含量约为2.5mg/ml，牛乳0.5-1.0mg/ml，鼠乳0.1-0.8mg/ml。编码牛α-乳清蛋白及人α-乳清蛋白的基因序列已得到阐明；有类序列信息分别由Vilotte等在Biochemie 69609-620(1987)和Hall等在Biochem J242735-742(1987)发表。本专利技术寻求利用基因工程技术构建重组的基因，使得这种重组基因构建物在哺乳类细胞中表达时即可在乳中产生含量高于1.0mg/ml，如1.2mg/ml或更高的α-乳清蛋白。所述构建物一般适于在非人类的动物细胞尤其是牛细胞中表达。一方面，本专利技术提供了一种适于在非人类动物细胞优选牛细胞中表达α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分的重组表达系统。优选地，本专利技术的重组表达系统适于表达人类α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。本文使用的术语“表达系统”是指包括蛋白编码区并连结到所有对蛋白表达必要的遗传信号的基因序列。任选地，表达系统也包括诸如启动子、增强子等调节元件以增强蛋白编码区域的转录和/或翻译，或者控制表达。调节元件可位于蛋白编码区域的上游或下游，或者位于蛋白编码区的内含子(非编码部分)中。蛋白编码区域序列自身具有调节能力也是可能的。术语“功能等价物”指任何与参考序列或蛋白功能实质等价的衍生物。“功能等价物”尤其包括那些核苷酸和/或氨基酸序列被插入、缺失或替换但对生物学功能尤其是产乳生物学功能没有明显不利影响的衍生物。基因工程对研究或是对商业目的均是有力的技术。使用基因工程技术(见Maniatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1982和“Principle of Genetic Engineening”，Old and Primrose，第5版，1994，两文均引为文献)可将外源遗传物质转入宿主细胞，在其中复制和/或表达由该外源遗传物质编码的蛋白或多肽。为了操作简便，遗传工程通常用原核微生物如E.coli等作宿主，但也使用真核生物尤其如酶母、藻类等。在一些应用中也使用真核细胞培养。Brinster等在Cell27223-231，1981中描述了将基因显微注入单细胞胚胎原核中所引起的哺乳类基因改变。这里外源遗传物质引入动物受精卵中，该受精卵在植入养母体内后进一步以正常方式发育成胚胎。真正的转基因动物在每一细胞中均含有外源DNA拷贝。一旦注入的遗传物质成功整合到宿主染色体，该动物即称为“转基因动物”并且转移的基因以正常的孟德尔方式遗传，但基因转移操作成功率较低，尤其是对大型饲养动物如猪、羊、牛等。至今还不可能控制转移的基因整合进入宿主染色体的位置。一定条件下仅产生“镶嵌型”的供体动物对于本专利技术的目的来说已经是很充分的。此时转移的基因整合到仅仅一定器官的染色体中。镶嵌型动物一般通过将外源DNA引入发育较晚期的胚胎而得到。牲畜转基因的最具前景的应用之一是，利用哺乳动物乳房作为“生物反应器”生产含药用及营养价值重组蛋白的乳。对表达外源蛋白而言，哺乳动物乳房因其以分泌方式大量生产蛋白而颇具吸引力。重组DNA技术可用来改变用于人或动物消费的牛乳的蛋白成份，如在牛乳中表达人乳蛋白可增加其作为婴幼儿食品的营养价值。(Strijker等，Harnessing Biotechnology for the 21st Century，Ladisch and Boser编辑，美国化学协会，38-21页(1992))。用普通和高级饲养技术繁殖多产动物从而较便宜地增加产量对上述重组技术应用是有益的。在哺乳动物乳房表达转基因的第一步是克隆感兴趣蛋白的基因。为了使蛋白表达到乳中，一般使用在乳中表达主要乳蛋白基因的启动子。乳蛋白基因受到严格调节，在非乳房组织中不表达，以使对其它组织负面影响的可能性降到最小。用来在乳房中表达异源蛋白的调节基因有α-S1-酪蛋白(Strijker et.，1992，上述文献)，β-乳球蛋白(Wright等，生物技术9831-834(1991))，乳清酸性蛋白(Ebert和Schindler，转基因农用动物进展报告(1993))和β-酪蛋白(Ebert Schindler，1993，上述文献)。新的基因构建物在用于牛之前一般先在转基因小鼠中检验。对得自转基因小鼠的乳作重组蛋白定量分析，如果乳量充足，可分离蛋白检查其结构特征和生物活性。对用于牛的特定构建物的选择主要考虑表达水平和所产生的重组蛋白的真实程度。牛的转基因通常始自注射数百拷贝的基因构建物到合子两个原核中的一个。合子取自体内输卵管(Roschlau等，Arch Tierz，Berlin313-8(1988)；Roschlau等，繁殖与受精杂志(Suppl38)，哺乳动物卵操作的细胞生物学，Greve等编辑(1989)；Hill等，Theriogenology37222(1992)；Bowen et al.生物繁殖50664-448(1994))或对体外成熟的卵作体外受精(Krimpenforth等，生物技术9844-847(1991)；Hill等，1992，上述文献；Bowen等，1993上述文献)。牛的合子需在15,000×g离心数分钟从中除掉不透明的脂类，以便用相差显微镜，Nomarski和Hoffman干涉相差显微镜观察原核。将2-4pl含数百个DNA构建物拷贝的缓冲液注入原核。转基因被认为是整合进入到染色体DNA的随机断点，该断点由显微注射中机械裂解产生。最理想的是，转基因在合子阶段DNA复制前整合，确保成体中每个细胞含有转基因。一般转基因的数个“拷贝”成线状连结，整合到单个染色体的单个位点。整合位点是随机的。整合可能在第一轮DNA复制后发生，也可能晚至2或4细胞阶段发生(Walland Seidel，1992)，产生转基因镶嵌型的动物。高至30％的可在体细胞组织检查到转基因的动物不向后代传递该转基因(或传递率低于预期的50％)。显微注射后，胚胎直接转移到受体的输卵管内或者培养数天后转移到受体牛的子宫内。通过对初生牛犊组织样品的Southern印迹分析，证明转基因的整合。而转基因的表达通过分析适当组织中的基因产物来测定，本专利技术是分析乳中的基因产物量。显微注射后胚胎存活率，转基因整合频率，表达频率和水平，配子系传递频率，均因注射的DNA构建物的量和质、所使用的小鼠品系(Brinster等，Proc Natl Acad Sci USA824438-4442(9185))及操作人员的技术技巧不同而相异。此基本方法已用于生产转基因绵羊(Wright等，1991，上述文献)，转基因山羊(Ebertand Schinder，1993，上述文献)，转基因猪(R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组基因构建物，该构建物适于在牛细胞中表达α－乳清蛋白或其功能等价物或其部分。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：朱利安库普尔，安琪莱克施涅克，
申请(专利权)人：PPL治疗学苏格兰有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]