与人CD95结合的多肽基序及其多肽制造技术

本发明专利技术涉及与人细胞膜表面膜蛋白分子ＣＤ９５结合的多肽基序（ｍｏｔｉｆ，又称多肽结合模型）及其多肽，以及编码这些多肽的ＤＮＡ序列。这些多肽通过与ＣＤ９５胞外区结合，诱导或阻断人体内ＣＤ９５↑［＋］细胞发生程序性死亡，从而调节ＣＤ９５系统参与多种疾病的发生、发展和愈后过程，因此可作为制备多肽药物或药物前体在治疗肿瘤、ＡＩＤＳ、老年性痴呆、帕金森综合症等涉及ＣＤ９５系统功能失调的疾病以及用于器官移植的转基因动物方面得到应用。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及与人细胞膜蛋白分子CD95结合的多肽基序及其多肽分子，特别是与CD95胞外区结合的功能性多肽。此外，本专利技术涉及编码这些多肽的DNA、RNA。由于这些多肽与CD95分子胞外区的结合位点进行结合，可阻断或诱导细胞引发自身死亡程序而使细胞死亡，因此本专利技术还涉及这些多核苷酸和多肽在制备可用于诊断和治疗与CD95系统相关的疾病的试剂或药品中的应用。自1980年Wyllie首次提出细胞程序性死亡的概念(Wyllie-AH,Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated withendogenous endonuclease activation.Nature.1980 Apr 10；284(5756):555-6)以来，人们逐渐认识到，细胞程序性死亡是多细胞生物体内普遍存在的细胞死亡方式。多细胞生物体依靠细胞程序性死亡，与细胞增殖和分化共同平衡着体内细胞的数量和种类，保证生物体正常的发育和生理过程。这种通过激活自身的死亡程序杀死自身的死亡方式，具有特征形态的典型变化，又称做细胞凋亡。启动细胞凋亡的关键性蛋白分子是细胞表面膜蛋白分子CD95，常称做Fas或死亡分子。，一旦CD95与其天然配体结合后，便可激活该细胞的死亡程序来消除自身。由此可见，正常凋亡功能是机体一切正常活动的根本，临床上也常观察到不能正常进行细胞凋亡过程的个体常伴有重大疾病的发生，如癌症、自身免疫性疾病和病毒感染等。此外，许多以细胞退化作为特征的疾病如神经退化性失调、获得性免疫缺陷综合症等，也存在细胞凋亡加速的作用。其中，CD95系统扮演着重要的角色。CD95所诱导的细胞凋亡与多种疾病密切相关，所诱导凋亡的水平高低直接影响着疾病的发生、发展和愈合。例如，病毒感染性疾病的一个典型例子便是AIDS。患者体内由HIV直接感染而引起的CD4*细胞死亡，仅占被破坏的CD4+细胞中的少数。而大量CD4+细胞的死亡是通过凋亡而消除的HIV病毒表面蛋白gp120与人体内细胞表面CD4分子结合，并刺激感染细胞产生多种细胞因子，这些细胞因子或HIV感染又进一步促进细胞表达CD95增加，从而导致细胞走向凋亡。病毒性肝炎，包括慢性乙肝患者和丙肝患者的肝细胞损害也与T淋巴细胞使用CD95受体-配体系统诱导凋亡有关。在病毒感染的肝脏中，浸润淋巴细胞识别肝细胞表面病毒抗原而受到活化并表达CD95L，对CD95表达增强的肝细胞进行凋亡诱导而杀死肝细胞。另外，凋亡的调控功能失常与肿瘤的发生关系密切。机体突变细胞往往异常增生而CD95诱导凋亡的功能下降，使之存活而发生肿瘤。良性肿瘤向恶性肿瘤转化时，也常常是由于恶性肿瘤细胞死亡速率下降所致。用CD95系统可诱导成人T细胞白血病细胞系发生凋亡，这些实验结果提示调控CD95诱导凋亡的作用可以作为肿瘤治疗的一个新思路。此外，目前许多中枢神经退行变性疾病，包括老年性痴呆、Alzheimer和帕金森综合症(Parkinson)，多是由于神经系统的细胞凋亡过多，是正常神经组织细胞也通过凋亡而消除，影响了神经系统的功能，导致神经退化性疾病。此外，表达CD95L的组织细胞与淋巴细胞表面的CD95结合诱导细胞凋亡可以来消灭前来进攻的活化淋巴细胞以使组织获得免疫豁免。这一现象可用于异种器官移植将移植组织细胞转入FasL基因使之表达FasL，通过建立免疫豁免来提高器官移植的成功率。由于CD95与疾病的发生、发展及愈后都密切相关，因此临床上可利用调节CD95诱导细胞凋亡的功能来达到治疗的目的。目前能够与CD95结合并具有一定功能的分子仅有人工制备的抗CD95抗体和天然的人CD95L。天然的人CD95L表达并不广泛，仅在激活的淋巴细胞表面。纯化天然CD95L不仅技术困难，而且规模化的制备不现实，因此不适用于临床，目前仅有少量的人CD95L用于科研实验，并且价格昂贵。人工制备的抗CD95L抗体是小鼠抗人CD95的抗体，对于人体是一种异种蛋白抗原分子，会产生免疫排斥反应，存在鼠源性问题，不能用于临床。另外，与细胞表面CD95竞争结合CD95L来达到抑制凋亡目的的分子有可溶性Fas分子(Fas胞外区部分)、Fas.Fc(Fas胞外区部分与人IgG的Fc段融合分子)。本专利技术从另一个角度，从蛋白分子相互作用的机理出发，以小分子量多肽分子模拟人天然的FasL对Fas的结合位点对Fas进行结合，从而诱导细胞发生凋亡或者用多肽占据它们的作用位点达到阻断凋亡的目的。与单抗相比较，小分子量的多肽结构清楚，与Fas的结合区域局限，不易发生多肽与多肽之间的空间位阻效应，也没有Fc段的干扰。此外，多肽的抗原性低(几乎没有)，不存在鼠源性单抗人源化的问题，副作用小，也很容易制备成多价交联状态以增强其活性，而且易于大规模生产、使用方便等特点，因而在相关药物研制方面具有巨大的应用潜力。此外，与人CD95特异性结合的多肽可作为检测、诊断试剂。将具有诱导凋亡功能的多肽编码DNA制备转基因动物，使转基因动物的组织细胞表达该多肽。由于多肽具有诱导凋亡的功能，因此可以诱导前来进攻的淋巴细胞发生凋亡，以在受体体内产生免疫豁免，延长异种器官的存活，这也是异种器官移植研究中的一个策略。这里，与CD95或Fas结合是指细胞膜表面膜蛋白受体分子CD95、可溶性Fas分子、Fas.Fc融合型分子等含有Fas蛋白分子胞外区的各种形式的分子。CD95，又名Fas、APO-1，它们均是同一个蛋白分子。CD95L有时也称做FasL、APO-1L，均是指同一个蛋白分子，是CD95的天然配体。本专利技术所涉及的多肽是指与细胞膜表面蛋白受体CD95胞外区结合的多肽，或者与可溶性CD95分子结合的多肽，包括融合型多肽和游离型多肽。CD95受体的多肽配体包含Motif IDNo:1或Motif ID No:2序列特点或与其实质上等同的序列代表的氨基酸序列的任何多肽。例如，除包含MotifID No:1或MotifID No:2氨基酸序列特点的多肽或蛋白质外，本专利技术的配体多肽包括包含某些氨基酸序列的蛋白质，所说的氨基酸序列与含有Motif ID No:1或Motif IDNo:2序列特点的多肽配体的氨基酸序列同源性为50-99.9％，优选地为70-99.9％，更优选的为80-99.9％，尤其优选地为90-99.9％，并具有诱导或阻断凋亡的功能活性。这里所使用的术语“实质上的等同物”意思是所说蛋白质的活性(例如所说的配体和所说的受体的结合活性)和物理特性实质上相同。氨基酸的取代，缺失或插入有时在多肽的物理和化学特性上不产生根本的变化。其中，包含取代、缺失或插入的多肽将被认为与缺乏取代、缺失或插入的多肽是实质上的等同物。在所说的序列上的一个氨基酸的实质上等同的取代基可以是选自所说的氨基酸所说类别的其它成员。非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、经氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酞胺。正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，即使存在程度上的差别(如受体连接活性的强度和多肽的分子量)也是允许的。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种配体多肽，是与ＣＤ９５结合的多肽，并含有［Ｍｏｔｉｆ ＩＤ Ｎｏ：１］或［Ｍｏｔｉｆ ＩＤ Ｎｏ：２］的多肽基序特征的多肽或与其实质上等同的序列代表的氨基酸序列或其部分肽，或其酰胺或酯或其盐的多肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李华，邹强朱，锡华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]