苦参凝集素和其抗虫、抗病编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供从植物中药苦参中分离具有杀虫（蚜虫）、抗病包括棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌和水稻稻瘟病菌的苦参凝集素，涉及苦参凝集素的分离及抗菌效果，克隆编码这一蛋白的基因全长ｃＤＮＡ序列，这一蛋白及其前导肽氨基酸序列。这一蛋白对杀虫和抗病是有用的，这一基因对利用现代生物技术增强农作物的抗病虫害能力是有用的。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
植物凝集素是一类结合特异糖类的蛋白质，部分具有杀虫作用。近年来在抗虫植物基因工程研究领域，有关凝集素的研究逐渐引起了科学家们的重视。凝集素早期的定义“lectin”来源于拉丁文“legere”，意思是选择，以强调其能选择性地与糖复合物相结合的特性。后来由于lectin被广泛应用于表现出更广泛凝集行为的所有蛋白质，故“lectin”已失去早期选择的意思，而另外一个名字“agglutinin”作为lectin的同义词，能更准确地反映这类蛋白质的特性，因为它是指能通过与细胞表面结合碳水化合物的特异性结合而使细胞凝集的所有蛋白质。由于植物凝集素家族成员的增加，对其结构、功能研究的深入以及分子生物学水平上新的发现，使得植物凝集素的定义几经修正。Peumans和Van Damme(Plant Physiology,109:347-352,1995)认为凝集素的定义应为含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的蛋白质总称。植物凝集素由于其独特的生化性质而广泛用作科研工具，在生物学和医学研究中，用于分离和鉴定糖蛋白和糖脂，研究细胞和组织化学、细胞分型、分离淋巴细胞和骨髓细胞，评估疾病患者的免疫状态以及染色体分型等。近年来对凝集素在植物中的抗病、抗虫及抗逆作用，及其结构与生物学功能方面的研究也有许多报道。关于植物凝集素的杀虫机理，目前一般认为外源凝集素进入昆虫消化道后，与肠道围食膜细胞表面的糖蛋白结合，降低膜的通透性，从而影响营养物质的正常吸收。次外，这种结合还可能在昆虫的消化道内诱发病灶，引起消化道内细菌和病毒的繁殖等，从而对昆虫本身造成危害(Eisemann C.H.,et al.EntomologiaExperimental et Applicata.72:1-10,1994)。对于植物凝集素的抗病作用，则认为是由于凝集素与病源微生物表面结合从而阻碍其繁殖或杀死病源微生物。目前国际上主要有PSA、WGA、GNA、PTA等几种植物凝集素用于杀虫基因工程育种，而其显著功效也只限于杀虫作用，未表现出良好的抗病能力。能用于抗病，特别是抗真菌病害基因工程育种的凝集素及其编码基因甚少报道。植物病害一直是造成作物产量损失的主要原因之一，特别是真菌病害，占病害的80％左右。虽然传统的常规育种也选育出了大量抗病品种，但是选育历程较长，病源小种的分化速度又往往超过品种更新换代的速度，通常情况下育种家花费十几年努力育成的一个新的抗性品种，几年内就可能被一个新的病原菌征服，这无论在时间上和精力上都是极大的浪费，更兼之所借助的化学杀菌剂不仅成本高，而且构成对环境的极大威胁。因此，自植物基因工程问世以来，它在植物抗病育种中的应用前景就受到了广泛的关注，建立在现代分子生物学技术基础上的基因工程方法，突破了物种间难以杂交的生殖隔离屏障，为培育抗病植株提供了新的可能，而其中的关键在于抗性基因的获得，但目前植物抗病基因的缺乏极大地制约了基因工程的发展，因此，基因工程的发展关键落到了功能明确的基因分离克隆上，而获得功能明确的基因的一个极佳方法便是基于功能蛋白的氨基酸序列。在作物的病害中苦萎病被比喻为棉花的肿瘤，其流行时，棉花将大量减产，稻瘟病则是水稻三大病害之一，全国主要产区都有发生，对水稻的危害极大，流行严重时将颗粒无收；而赤霉病对小麦也是传播广、严重影响产量的病害。针对现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种从天然中药植物苦参中分离纯化的苦参凝集素蛋白，它不仅表现出对蚜虫的毒杀作用，且表现出对以上三种病菌的显著抑制作用，因此，苦参凝集素蛋白的分离纯化及其编码基因的分离克隆为现代基因工程育种提供了功能明确的功能基因。本专利技术的目的通过以下技术方案达到一种从植物苦参根茎中分离的苦参凝集素蛋白基因，其特征在于具有编码氨基酸序列为SEQ ID No:13，并具有杀虫，抗病作用的凝集素蛋白。上述的凝集素蛋白基因是具有编码下述蛋白(a)或(b)的核苷酸序列(a)具有SEQ ID No:13氨基酸序列的蛋白；(b)具有在SEQ ID No:13的氨基酸序列中通过缺失、替代、修饰或添加一个或几个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并能够表现出凝血活性及杀虫抗病能力。上述凝集素蛋白基因，具有编码下述蛋白(a)或(b)的核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因(a)具有SEQ ID No:1氨基酸序列的蛋白；(b)具有在SEQ ID No:1的氨基酸序列中通过缺失、替代、修饰或添加一个或几个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并能够表现出凝血活性及杀虫抗病能力。上述凝集素蛋白基因具有编码氨基酸序列为SEQ ID No:3的凝集素蛋白前导肽的核苷酸序列。上述凝集素蛋白基因具有编码下述多肽(a)或(b)的苦参凝集素蛋白前导肽核苷酸序列(a)具有SEQ ID No:3氨基酸序列的多肽；(b)有在SEQ ID No:3的氨基酸序列中通过缺失、替代、修饰或添加一个或几个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并具有信号肽作用的多肽。上述凝集素蛋白基因具有SEQ ID No:2、4、7核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因。上述凝集素蛋白基因具有SEQ ID No:9、10、11、12核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因扩增引物。上述凝集素蛋白基因具有苦参凝集素蛋白基因部分核苷酸序列的基因片断。上述的基因片断的核苷酸数目在从15到50的范围内。本专利技术采用的基因工程技术可根据一般方法完成，例如，在“分子克隆实验指南第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社，ISBN 0-87969-6；“当前分子生物学方法”(1987),John Wileyand Sons,Inc.ISBN 0-471-50338-X；和“当前蛋白科学方法”(1995),John Wiley and Sons,Inc.ISBN 0-471-11184-8中所述；凝集素凝血实验方法依照Van Damme et al.,Plant Mol.BioL.29,579-598(1995)中所述进行。这里的苦参凝集素是指从中药苦参中分离的具有一级结构为SEQ ID No:1氨基酸序列的蛋白质，其分子量为32kD，对兔血及四种血型血都有凝集作用，其凝血活性可被甘露糖和果糖抑制，麦芽糖和葡萄糖有弱抑制作用，其分子含有2.89％的中性糖；对棉花枯萎病、小麦赤霉病和水稻稻瘟病菌丝体的生长有明显的抑制作用；苦参凝集素基因指具有编码苦参凝集素及其前导肽的全长cDNA核苷酸序列SEQ ID No:2，其中SEQ ID No:3为苦参凝集素前导肽氨基酸序列，SEQID No:4为编码前导肽氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID No:5为全长cDNA中3’非编码区，SEQ ID No:6为全长cDNA中5’非编码区，SEQ ID No:7为编码苦参凝集素蛋白基因的cDNA 3’核苷酸序列。苦参为豆科槐属植物，其根作药用。其有抑制结核杆菌及皮肤真菌和灭蛆作用。根据本专利技术的一个优选实施方案，取苦参块根剪碎，生理盐水浸泡，48小时后用高速组织捣碎机捣碎，再经离心收集上清液，向上清中加入固体硫酸氨达70％-90％饱和度，调节pH至6.0-6.5，离心收集沉淀，按以上文献记载方法沉淀用PB(磷酸盐缓冲液)液溶解透析；透析液用DEAE-Sepharose纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从植物苦参根茎中分离的苦参凝集素蛋白基因，其特征在于：具有编码氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３，并具有杀虫，抗病作用的凝集素蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：鄢波，马志刚，黄兴奇，王玲仙，曾仲奎，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]