本发明专利技术公开了杨树菇凝集素AAL-2及其编码基因、其制备方法和应用。本发明专利技术采用亲和层析方法从杨树菇（Agrocybe?aegerita）总蛋白中分离得到凝集素蛋白AAL-2，其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示，编码该蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。细胞试验表明,本发明专利技术所分离杨树菇凝集素AAL-2具有优异的杀伤肿瘤细胞活性，能够引起肝癌细胞发生显著性的凋亡。动物实验表明，AAL-2对肿瘤有较好的治疗效果。糖芯片技术检测结果显示,AAL-2优先结合以N-乙酰葡萄糖胺为末端的糖或糖蛋白，可将其作为检测与N-乙酰葡萄糖胺相关的病症试剂或作为检测N-乙酰葡萄糖胺相关糖结构的试剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从真菌中分离到的凝集素及其编码基因，尤其涉及从杨树菇(Agrocybe aegerita)中分离到的凝集素AAL-2及其编码基因，本专利技术还涉及杨树燕凝集素AAL-2的分离方法及其在抗肿瘤或检测与N-乙酰葡萄糖胺相关的病症及与N-乙酰葡萄糖胺相关糖结构中的应用，属于杨树菇凝集素的分离和应用领域。
技术介绍
药用真菌在东方因其独特的药用价值(尤其是它的抗肿瘤活性)有着两千余年的历史。直到上世纪50年代，随着技术的成熟和多糖等有效成分的分离鉴定，药用真菌的药 用价值才逐渐被欧美研究者所重视，越来越多的药用真菌活性成分在动物和临床试验中进行筛选并得到验证，成为抗肿瘤药物的筛选宝库。杨树燕(Agrocybe aegerita),又名柱状田头燕、杨树燕、柳松鸾等，隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑属。杨树菇富含人体必需的八种氨基酸，其中赖氨酸高达I. 75%，其营养价值超过香菇、金针菇等其它食用菌，同时又具有独特的药用价值，民间常将其用于抗癌、降血压，治疗胃冷、肾炎、水肿等，具有独特疗效，但其中的药理成分并不明确。原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率和死亡率分别列第七位和第三位。中国肝癌的发病率为25. 7/10万，仅次于肺癌和胃癌，而其病死率高达23. 7/10万，在中国的肿瘤病死率中列第二位。目前公认的肝癌诊断疗法有超声波诊断，皮下乙醇注射，放化疗以及手术切除等方法，但是肝癌的复发率和转移率较高。因此，亟待寻找更加有效抑制肝癌或杀死肝癌细胞的药物或方法。凝集素(lectin)是自然界中广泛存在的一种非免疫来源的蛋白，能够可逆的结合多种糖或糖蛋白，并且这种结合不同于酶和底物的结合方式。至今，人类已经分离出数百种凝集素，每种凝集素都有其独特的生化特性、糖结合特异性和广泛的生物活性，譬如抗肿瘤活性，抗真菌活性和抗病毒活性等。孙慧等通过阴离子交换层析的方法从杨树菇总蛋白中分离得到凝集素AAL，并验证其具有广谱的抗肿瘤效果，对直肠癌、宫颈癌、胃癌、血癌细胞等癌细胞均有杀伤活性，其中，对血癌细胞HL60的杀伤活性高于阳性对照药阿霉素(孙慧等，杨树菇凝集素AAL具有抗肿瘤活性.Biochem. J. (2003) 374，321-327)。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种从杨树燕(Agrocybe aegerita)中分离到的新的凝集素；本专利技术目的之二是提供一种从杨树菇分离或制备上述凝集素的方法；本专利技术目的之三是提供编码上述所分离的杨树菇凝集素的cDNA ；本专利技术目的之四是提供上述杨树菇凝集素及其编码基因的药理用途；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的 本专利技术通过亲和层析方法从杨树菇总蛋白中分离得到一种新的凝集素，命名为杨树菇凝集素AAL-2，其氨基酸序列为以下(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而获得的仍具有杨树燕(Agrocybe aegerita)凝集素AAL功能的多肽变异体。优选的，本专利技术所述的杨树燕(Agrocybe aegerita)凝集素AAL-2为SEQID NO 2所示的氨基酸序列。本专利技术中所述的“多个”通常意味着通常为1-50个，较佳的1-30个，更佳的1-20个，最佳的为2 4个，这些取决于凝集素AAL-2三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸序列进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。所述 的“缺失”是指氨基酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基或者在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳的为10个以内，更佳的为5个以内)氨基酸。本专利技术所述的杨树菇凝集素AAL-2的多肽变异体包括同源序列变异体、保守型变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨杂交条件下能与杨树燕凝集素AAL-2核苷酸序列杂交的DNA所编码的蛋白以及利用抗杨树菇凝集素AAL-2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的祀序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes," Overviewof principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10°C。TmS在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、PH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在^下在平衡状态下50%的探针被占据)。严谨条件可为以下条件其中在PH7. O到8. 3下盐浓度低于约I. OM钠离子浓度，通常为约O. 01到I. OM钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30°C，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60°C。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。作为参考，所述的“严谨杂交条件”可如下50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培养；或5XSSC,1% SDS，在65°C下培养，在0. 2XSSC中洗涤和在65°C下于0. 1% SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。本专利技术所述的多肽变异体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的变异体或片段，其中，由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域普通技术人员所习知。本专利技术还提供了其它多肽，如包含杨树菇凝集素AAL-2或其片段的融合蛋白。本专利技术还包括杨树菇凝集素AAL-2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然杨树菇凝集素AAL-2多肽的差异可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响氨基酸序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物以及具有非天然存活的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。所述的本文档来自技高网...
【技术保护点】
杨树菇（Agrocybe？aegerita）凝集素AAL？2，其特征在于,其氨基酸为以下（a）或（b）所示：（a）SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列；或（b）将SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而获得的仍具有SEQ？ID？NO：2所示氨基酸功能的衍生序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙慧，姜帅，谷变利，陈义杰，余国军，尹亚琳，
申请(专利权)人：武汉奥力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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