本发明专利技术公开了一种番茄花叶病毒云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液，盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液和底物，盒体内的用液还包括番茄花叶病毒云南分离物的多克隆抗体、番茄花叶病毒云南分离物的单克隆抗体，所述的番茄花叶病毒云南分离物多克隆抗体和所述的番茄花叶病毒云南分离物单克隆抗体由２０～３０ｍｇ／ｍｌ病毒浓度的番茄花叶病毒提取液作为免疫抗原，分别采用免疫注射法、单克隆抗体法制备而成；本发明专利技术所述的检测试剂盒检测灵敏度高，检测灵敏度可达到０．０１～０．００１ｎｇ／ｍｌ，比间接ＥＬＩＳＡ和ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测灵敏度提高１００～１０００倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物技术产品，具体涉及一种番茄花叶病毒(Tomato mosaicvirus，ToMV)云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
植物病毒是农作物病毒病害的重要病原，随着植物脱病毒种苗产业化的发展和现代设施农业的兴起，植物病毒的检测与防控技术日益受到重视。目前植物病毒的检测技术有血清学技术、指示植物测定、电子显微镜检测、分子检测(包括对病毒核酸及蛋白的检测)4个方面的方法。各种方法相互印证，同时又存在检测的灵敏度、专化性、设备设施条件及成本等因素的局限。各国都在探索简便、快速、准确而又经济的检测办法，其中以血清学反应原理为基础的酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked immunosorbent assay，ELISA)是被广泛改进和应用的方法。1969年，Avrameas将酶联抗体应用于血清学技术中，1971年Engvall和Perlmann将该方法进一步完善专利技术了ELISA方法。1974年Voller等将ELISA技术应用于人和动物的抗体检测，Voller等和Clark、Adams分别于1976年和1977年将ELISA方法应用于植物病毒的检测。之后，ELISA方法得到进一步发展，并广泛应用人和动植物病毒的检测中。与其它检测方法相比，ELISA方法具有成本显著降低，检测的设备设施简单，快速高效的特点，并始终在不断被改进中，有直接ELISA、间接ELISA(I-ELISA)、单抗体ELISA(SPA-ELISA)。微波ELISA、双抗体夹心ELISA(Double-antibody sandwich-ELISA，DAS-ELISA)等。目前市售的ELISA检测试剂盒主要有I-ELISA和DAS-ELISA。如美国的Agdia公司，英国的PD公司、意大利的Agritest公司、德国的Loewe生物技术公司、瑞士的BIOREBA公司是植物病毒检测试剂盒的主要营销公司。我国的植物病毒检测试剂盒销售公司大多为这些公司的代理或进口试剂盒分装销售，也有自行研制的报道，但涉及植物病毒种类较少。目前市售的ELISA检测试剂盒可用于脱毒种苗和植物病毒样品的批量化检测，但同时也存在非特异性反应(即假阳性或假阴性反应)、检测灵敏度不够高(一般为1ng/ml-10ng/ml病毒浓度)。尤其在我国，许多种类的植物病毒抗体依赖于进口，一方面受到进口血液制品的限制，难以稳定供应，另一方面国外的抗体生产成本高而导致价格昂贵，未能满足生产的需求。近年来国外的相关公司对植物病毒检测试剂盒进行了改进，进一步简化了操作程序，如英国PD公司的试纸条检测方法已实现商品化生产，但价格高昂，每样次的检测需100多元人民币。国内外生产中规模化应用的仍然是I-ELISA和DAS-ELISA检测试剂盒，根据病毒种类的不同，每样次的试剂成本约10-30元人民币不等。Roggero和Ogliara等1996年在DAS-ELISA基础上，加入单克隆抗体，开展了番茄班萎病毒(TSWV)的三抗体夹心ELISA(Triple-antibody sandwich ELISA，TAS-ELISA)检测，继承了DAS-ELISA简便快速的优势，同时结合了单克隆抗体专化性强、灵敏度高的特点，可高效、快速和灵敏地检测待测样中的病毒抗原。本专利技术的技术人员近年来用TAS-ELISA检测了双生病毒云南分离物(已发表多篇相关论文)，郭兴启等(2003)应用TAS-ELISA检测了马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)、美国和我国台湾分别报道了TAS-ELISA检测康乃馨蚀环病毒(CarERV)和坏死病毒(LNV)，Franconi(2002)报道了TAS-ELISA检测PVX，Bowman等(2002)应用该办法检测黄瓜花叶病毒(CMV)，Tavert等(2002)应用TAS-ELISA检测烟草花叶病毒(TMV)运动蛋白。目前从现有的文献报道来看，有关TAS-ELISA方法研究植物病毒的报道近年虽然有所增加，但专门研制TAS-ELISA检测试剂盒应用于植物病毒的规模化检测尚未发现，同时市场中尚无TAS-ELISA检测试剂盒的出现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种灵敏度高、准确性强、高效的番茄花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供一种番茄花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒的制备方法，该方法简便易行、易于规模化生产。为了实现本专利技术目的，本专利技术的番茄花叶病毒云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液，盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液和底物，其特征在于，盒体内的用液还包括番茄花叶病毒多克隆抗体、番茄花叶病毒单克隆抗体，所述的番茄花叶病毒多克隆抗体和所述的番茄花叶病毒单克隆抗体由20-30mg/ml病毒浓度的番茄花叶病毒提取液作为免疫抗原，分别采用免疫家兔和免疫小鼠法制备而成。所述的番茄花叶病毒提取液的制备方法为先将含有番茄花叶病毒的病叶破碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1～3(克/毫升)，匀浆，过滤，滤液中加入滤液体积20～30％的氯仿，搅拌，收集上清液；然后在上清液中加入聚乙二醇(PEG)至浓度为4～8％(克/毫升)，氯化钠终浓度为0.1M，溶解后静置取沉淀，沉淀用0.01M磷酸盐缓冲液悬浮，重复沉淀、悬浮处理1～3次，取上清液加入离心管离心，沉淀用含0.01M MgCl2的0.02M磷酸钾盐缓冲液(KPB)悬浮，离心，上清液即为病毒提纯液。具体地说，所述的番茄花叶病毒提取液的制备方法为1)病叶剪碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1(克/毫升)，搅拌充分匀浆，过滤；2)滤液中加入滤液体积25～30％氯仿，搅拌5～20min，4℃下6000rpm离心5～20min，收集上清；3)上清液中加入PEG至浓度为6～8％(克/毫升)，NaCl终浓度为0.1M，溶解后4℃下放置4h～24h；4℃下离心力为10000g下离心10～30min；4)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下悬浮；5)悬浮液中加入PEG至浓度为4～8％(克/毫升)，NaCl终浓度为0.1M，，溶解后4℃放置4h～24h；4℃下离心力为10000g下离心10～30min；6)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下悬浮；7)在4℃、6000rpm离心转速下5～20min，取上清液；8)加入铺有10ml25％蔗糖垫的离心管，于4℃下33000rpm离心2～3h，沉淀用pH7.4～7.5，0.02M KPB(含0.01M MgCl2)悬浮，低速离心，取上清液即为病毒提纯液。所述的抽提缓冲液为0.02M磷酸盐缓冲液(PBS)，pH为7.4～7.5，含0.1％巯基乙醇。本专利技术所述的匀浆、过滤、离心和悬浮，均为本领域技术人员公知技术。经检测，本专利技术所述的病毒提纯液为乳白色液体，病毒浓度为20-30mg/ml。本专利技术所述的病毒提纯液纯度及含量采用电镜负染法及紫外分光光度仪进行检测，具体方法为1.电镜负染法检测病毒的纯度病毒提纯液上置电镜铜网吸附3min，本文档来自技高网...
【技术保护点】
番茄花叶病毒云南分离物ＴＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液，盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液和底物，其特征在于，盒体内的用液还包括番茄花叶病毒多克隆抗体、番茄花叶病毒单克隆抗体，所述的番茄花叶病毒多克隆抗体和所述的番茄花叶病毒单克隆抗体由２０～３０ｍｇ／ｍｌ病毒浓度的番茄花叶病毒提取液作为免疫抗原，分别采用免疫家兔和免疫小鼠法制备而成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张仲凯，周雪平，丁铭，方琦，李婷婷，苏晓霞，李展，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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