本发明专利技术属生化分析领域，涉及一种利用质谱靶板富集糖基化肽段的方法。本方法采用表面修饰硼酸基团的硅片作为基底材料，选择性捕获并富集溶液中的糖基化肽段，然后直接将硅片置于ＭＡＬＤＩ靶版上进行质谱分析。本发明专利技术能够快速、简便地捕获糖基化肽段并直接用于ＭＡＬＤＩ－ＭＳ检测且无需洗脱步骤。利用该方法可以将糖肽的质谱检测限提高两个数量级。此外，碳酸氢铵是质谱预处理中最常用到的一种盐，通常在酶解过程中大量存在，容易影响后续质谱分析。采用本方法，可以在捕获糖基化肽段的过程中同时去除２００ｍＭ高浓度的碳酸氢铵。与传统方法相比，减少了除盐步骤，也同时减少了样品损失。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生化分析领域，涉及一种靶上富集糖基化肽段的方法。具体涉及使用修 饰过的基质辅助激光解析质谱仪(MALDI-MS)的靶板富集并检测糖基化肽段的方法，本发 明能够快速、简便地捕获糖基化肽段并直接用于MALDI-MS检测且无需洗脱步骤。
技术介绍
；目前，公知的糖基化肽段富集手段主要有凝集素亲和色谱法、体积排阻色谱法、亲 水色谱分离法、胼腙反应法和硼酸亲和作用法。其中，凝集素亲和色谱法根据抗原抗体相互 作用，选择性的捕获特定结构的糖基化肽段，但存在适用范围较窄的缺点。该方法采用色谱 柱或固态微球为载体，将凝集素负载于载体之上用于糖基化肽段的富集。体积排阻色谱法 根据糖基化肽段的分子量较大的原理，根据分子量大小将肽段分开。该方法较为简单，通常 采用体积排阻色谱柱作为分离设备，但仅仅依靠分子量选择糖基化肽段带来了特异性较差 的问题。亲水色谱法根据糖链亲水的特征，选择性地捕获亲水性较高的肽段，认为这些肽段 通常为糖基化修饰的肽段。该方法采用亲水色谱柱作为分离手段，设备简单，但同样具有特 异性较差的缺点。胼腙反应法需要将糖链所包含的顺式邻二醇氧化为醛基，随后进一步与 固定于微球或色谱填料上的酰胼基团发生反应，从而实现捕获糖基化肽段的目的。该方法 具有特异性高的优点，但在氧化步骤中会引入副产物，增加样品复杂程度，影响后期质谱鉴 定。硼酸亲和富集法利用硼酸可以和糖链上的顺式邻二醇发生反应的特点，可以选择性的 捕获所有类型的糖链，具有较高的选择性和广泛的适应能力。目前已有商品化的负载硼酸 的磁性微球。上述方法无一例外全部采用色谱填料或固相微球作为载体，对糖基化肽段的 富集过程必须经过孵育、清洗和洗脱过程，步骤复杂且难以直接与基质辅助激光解析质谱 (MALDI-MS)兼容。处理微量且复杂程度不高的混合肽段样品时，传统手段步骤繁多、复杂， 容易造成样品损失。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有的富集糖基化肽段的方法步骤繁多、易损失微量样 品和不能直接与MALDI-MS衔接的不足，提供一种利用质谱(MALDI)靶板富集糖基化肽段的 方法，该方法操作简便，不易损失微量样品，而且无需洗脱步骤，可以方便地与MALDI-MS直 接衔接，进行质谱分析。具体而言，本专利技术提供的直接利用MALDI靶板富集糖基化肽段的方法，采用表面 修饰硼酸基团的硅片作为基底材料，选择性捕获并富集溶液中的糖基化肽段，富集了糖基 化肽段的硅片无需洗脱，直接置于MALDI靶板上进行质谱分析。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是采用商品化或自制表面镀金的单晶 硅片，本专利技术中，采用厚度1mm单晶硅片，将其切割成与MALDI靶板的样品点大小相同或略 小的硅片，然后通过巯基的表面自组装过程在金表面覆盖一层含有羟基或羧基末端的巯基 试剂，将金表面改性为巯基或羧基表面；羟基表面可以进一步通过丁二酸酐将其改性为羧3基表面；随后，在羧基活化剂的辅助下，加入氨基苯硼酸，将硼酸嫁接在硅片表面；将上述 完成修饰的硅片置于水蒸汽饱和的密闭容器中，随后将肽段混合溶液点在硅片上；一段时 间后，硼酸基团将与糖基化肽段结合；然后，用移液器将硅片上的液滴移去，此过程中，没有 与硅片结合的非糖基化肽段也被去除，最终，实现捕获糖基化肽段的目的。本专利技术中，使用末端羧基或羟基的巯基试剂作为表面自组装有机长链。本专利技术中，使用间氨基苯硼酸作为硼酸基团载体，通过其与有机链末端羧基的结 合来实现嫁接硼酸基团。本专利技术中，可以在富集糖基化肽段的同时，去除高浓度碳酸氢铵的影响，一步除 盐，避免额外除盐步骤造成的样品损失。本专利技术中，所述的硅片没有与MALDI靶板结合，若混合肽段溶液体积较大，无法依 靠表面张力完全置于硅片之上，可以将硅片投入混合肽段的溶液，直接在溶液体系中捕获 糖基化肽段，这样也同时保留了传统方法在大体积溶液中富集的优点。本专利技术中，捕获糖基化肽段的硅片可以直接置于MALDI靶板上进行质谱分析，无 需洗脱步骤，也避免了洗脱步骤中的损失。本专利技术中，由于金对肽段的吸附能力很弱，因此采用以金为表面的材料作为基底， 可以显著降低表面非特异性吸附。本专利技术中，能够被捕获的肽段是依靠表面硼酸与糖链中顺式二羟基的相互作用， 从而使得只有糖基化肽段被靶板捕获，达到选择性富集糖基化肽段的目的。本专利技术的有益效果是能从低浓度糖基化肽段溶液中的直接捕获糖基化肽段，捕获之后无需洗脱步骤， 直接将捕获了糖基化肽段的硅片置于MALDI靶板上进行质谱分析。由于减少了洗脱步骤， 不仅简化操作步骤而且避免了该步骤中糖基化肽段的损失，可以有效地富集微量或低浓度 的糖基化肽段，使其得到质谱检测。本方法可以将糖肽的质谱检测限提高两个数量级。此 外，碳酸氢铵是质谱预处理中最常用到的一种盐，通常在酶解过程中大量存在，容易影响后 续质谱分析。本方法可以在捕获糖基化肽段的过程中同时去除高浓度(200mM)的碳酸氢 铵。与传统方法相比，减少了除盐步骤，也同时减少了样品损失。附图说明图1是本专利技术的制作方法示意图，其中，“Gold coated Si wafer”指商品化或自制表面镀金的单晶硅片，厚度1mm， SA指丁二酸酐，MUD指11-巯基-1- i^一醇，DMAP指4- 二甲氨基吡啶，EDC指1_(3_ 二甲 氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，HOAt指1-羟基-7-叠氮苯并三唑，APB指间氨基苯硼酸。图2是本专利技术富集糖基化肽段具体步骤的示意图，其中，“Glycop印tide”指糖基化肽段，“Nonglycop印tide”指非糖基化肽段。图3是本专利技术富集三种糖基化蛋白酶解液中糖基化肽段的结果质谱图，其中，“Asialofetuin”指糖基化蛋白脱唾液酸胎球蛋白，“HRP”指辣根过氧化物 酶，“fetuin”指胎球蛋白。图4是本专利技术从大量非糖基化肽段中选择性的富集糖基化肽段的结果质谱图，其中，“BSA”指牛血清白蛋白。图5是本专利技术在富集糖基化肽段的同时去除高浓度碳酸氢铵的质谱图。具体实施例方式实施例1如图1所示，首先将商品化或自制表面镀金的单晶硅片(厚度1mm)切割成与 MALDI靶板的样品点大小相同或略小的硅片，用乙醇和水分别清洗表面三次，然后将上述硅 片浸入含有11-巯基-ι-十一醇的乙醇溶液中，振荡过夜，随后用乙醇和水分别清洗表面三 次以去除过量的Ii-巯基-ι-十一醇。此步骤通过巯基在金表面的自组装过程在金表面覆 盖一层含有羟基末端的有机长链分子。然后将上述硅片浸入丁二酸酐和4- 二甲氨基吡啶 的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，加热到60摄氏度反应3小时。由此，可以将有机链末端的羟 基转变为羧基。接下来，将上述硅片浸入1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 1-羟基-7-叠氮苯并三唑的乙醇溶液中，振摇30分钟后加入间氨基苯硼酸，继续振摇1小 时后，分别用水和乙醇清洗3次，从而得到表面嫁接硼酸基团的硅片。实施例2如图2所示，表面嫁接硼酸基团的硅片(下文简称硅片)可以通过简单的两步 实现对糖基化肽段的富集。首先，将含有糖基化肽段和50mM碳酸氢铵的肽段混合溶液点于 上述硅片上，由于表面张力的作用，肽段混合溶液(含有50mM碳酸氢铵)液滴可以很好的 保持在硅片表面。为了防止液滴中溶剂的挥发，将硅片置于盛有水的密闭容器本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用ＭＡＬＤＩ质谱靶板富集糖基化肽段的方法，其特征是采用硅片作为载体并对其表面修饰，将硼酸基团嫁接在硅片表面，然后采用该硅片对糖基化肽段进行富集；富集了糖基化肽段的硅片无需洗脱步骤，直接置于ＭＡＬＤＩ靶板上进行质谱分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许亚伟，张莉娟，陆豪杰，杨芃原，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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